Realización Electroforesis (Rh)

OBJETIVO

Seguimos con la practica para la determinación del Rh, ya tenemos preparadas las muestras directas para realizar la elecreoforesis.

MATERIALES

• Muestras de ADN
• Marcador de peso molecular
• Geles de Silver green y Dana green 
• Cubeta de electroforesis
• Controles negativo y positivo 
• TAE

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta colocando dos geles uno de Dana green y otro de Silver Green, con cuidado de que no se toquen, llenamos de TAE (tampón de electroforesis) la cubeta intentando que no se nos despeguen los geles
2. Procedemedos a cargar los geles, anotando siempre que estamos cargando y donde
3. Conectamos a la corriente los electrodos programamos el voltaje y tiempo de electroforesis

OBSERVACIONES

Al observar los resultados entendemos que o bien el tiempo de la electroforesis tenía que haber sido más largo o que el gel hubiese tenido una menos concentración, dado que la muestra a podido correr muy poco por el gel.

Determinación del Factor Rh por PCR

OBJETIVOS

Continuar aprendiendo sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el de la determinación del Rh, el factor Rh es una proteína integral de la membrana de los glóbulos rojos, positivos son aquellas personas que presentan dicha proteína en sus eritrocitos y negativa quienes no presenten la proteína. Esto es lo que vamos a determinar con esta prueba.Hoy prepararemos los geles donde posteriormente se hará la determinación y prepararemos las muestras y controles para llevar acabo la PCR.

Explicaré el crocedimiento de el gel de Dana Green, ya que el de Silver Green está en post anteriores.

MATERIAL

• Tubos de 0.2 mL
• Agarosa
• TBE 1x
• Mix PCR
• Agua de biología molecular
• ADN
• Control positivo
• Matraz Erlenmeyer
• DanaBlue 
• Agarosa

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL GEL CON DANA GREEN:

1. En un matraz Erlenmeyer de 100mL, añadimos 32 mL de tampón de electroforesis 1x más 0.60 gr de agarosa (2%)
2. Añadimos 80 μL de DanaBlue 0.1%, agitamos para disolver los grumos de agarosa.
3. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa llevándola a ebullición. La solución resultante tiene que aparecer clara, sin partículas aparentes.
4. Enfriamos la solución más o menos hasta 55%. 
5. Ponemos el peine en el molde y añadimos la mezcla cuidadosamente hasta que se enfríe del todo.
6. Lo sacamos del molde y lo guardamos hasta que los usemos para realizar la electroforesis.

PREPARACIÓN DEL LAS MUESTRAS DE PCR:

1. En el tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5 μL de Mix de PCR y 2.5 μL de agua de biología molecular, se mezcla bien. Este es el control negativo.
2. En otro tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de control positivo, mezclamos bien.
3. De nuevo en un tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de ADN, mezclamos bien.
4. Pasamos los tubos al termociclador. 

OBSERVACIONES

En el caso de de la preparación del gel las cantidades estaban dadas por el protocolo para geles de 7x7, pero en nuestro laboratorio no hay moldes de ese tamaño, si no más grandes, así que tuvimos que volver a hacer el protocolo como para otro gel, calentar la mezcla que teníamos y juntarlos para hacer un solo gel. El resultado fue bueno.

Extracción ADN de la Saliva

OBJETIVO

Extraer nuestro ADN para que lo podamos trabajar con él en la siguiente práctica.

MATERIALES

• Solución de Lisis
• Proteinasa K 
• Solución de Acetato de Sodio 
• Etanol absoluto
• Tubo ependorf
• Tubo de centrífuga
• Pipeta pasteur
• Asas de siembra
• Pipetas graduadas y puntas
• Agua de biología molecular

PROCEDIMIENTO 

1. Obtenemos la muestra de saliva, para ello nos enjuagamos antes con agua, luego nos rascamos un poco la mucosa bucal y la lengua con un asa de siembra para una mayor cantidad de ADN y nos enjuagamos con suero fisiológico.
2. Recogemos  10 mL de saliva con el suero fisiológico en un tubo cónico, nos ayudamos de un embudo.
3. Añadimos 1 mL de Solución de Lisis al tubo con la muestra.
4. Mezclamos por inversión.
5. Con la micropipeta añadimos 20 μL de Proteinasa K, para ello apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale.
6. Mezclamos por inversión.
7. Incubamos durante 10 minutos y agitamos cada 3 minutos.
8. Añadimos 200 μL de Acetato de Sodio, mezclamos por inversión.
9. Con una pipeta pasteur añadimos 3 mL de Etanol, que tiene que estar bien frío. Apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale lentamente.
10. Incubamos durante 2 min sin moverlo.
11. Mezclamos por inmersión muy lentamente.
12. Nos aparece una madeja de ADN que capturaremos con un asa de siembra y llevaremos a un eppendorf.
13. Para conservar el ADN para otro día llenamos el eppendorf con tampón de hidratación y metemos en el congelador.

OBSERVACIONES

Después de obtener la saliva con el suero fisiológico centrifugamos hasta obtener un pellet y después continuamos con el protocolo disolviendo el pellet todo lo posible por inversión, pero finalmente obtuvimos el ADN.