Determinación del Factor Rh por PCR

OBJETIVOS

Continuar aprendiendo sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el de la determinación del Rh, el factor Rh es una proteína integral de la membrana de los glóbulos rojos, positivos son aquellas personas que presentan dicha proteína en sus eritrocitos y negativa quienes no presenten la proteína. Esto es lo que vamos a determinar con esta prueba.Hoy prepararemos los geles donde posteriormente se hará la determinación y prepararemos las muestras y controles para llevar acabo la PCR.

Explicaré el crocedimiento de el gel de Dana Green, ya que el de Silver Green está en post anteriores.

MATERIAL

• Tubos de 0.2 mL
• Agarosa
• TBE 1x
• Mix PCR
• Agua de biología molecular
• ADN
• Control positivo
• Matraz Erlenmeyer
• DanaBlue 
• Agarosa

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL GEL CON DANA GREEN:

1. En un matraz Erlenmeyer de 100mL, añadimos 32 mL de tampón de electroforesis 1x más 0.60 gr de agarosa (2%)
2. Añadimos 80 μL de DanaBlue 0.1%, agitamos para disolver los grumos de agarosa.
3. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa llevándola a ebullición. La solución resultante tiene que aparecer clara, sin partículas aparentes.
4. Enfriamos la solución más o menos hasta 55%. 
5. Ponemos el peine en el molde y añadimos la mezcla cuidadosamente hasta que se enfríe del todo.
6. Lo sacamos del molde y lo guardamos hasta que los usemos para realizar la electroforesis.

PREPARACIÓN DEL LAS MUESTRAS DE PCR:

1. En el tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5 μL de Mix de PCR y 2.5 μL de agua de biología molecular, se mezcla bien. Este es el control negativo.
2. En otro tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de control positivo, mezclamos bien.
3. De nuevo en un tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de ADN, mezclamos bien.
4. Pasamos los tubos al termociclador. 

OBSERVACIONES

En el caso de de la preparación del gel las cantidades estaban dadas por el protocolo para geles de 7x7, pero en nuestro laboratorio no hay moldes de ese tamaño, si no más grandes, así que tuvimos que volver a hacer el protocolo como para otro gel, calentar la mezcla que teníamos y juntarlos para hacer un solo gel. El resultado fue bueno.