Observación de Cromosomas en Metafase

OBJETIVO

Después de teñir nuestra preparación pasamos a observar los cromosomas.

MATERIALES

• Microscopio
• Preparación 
• Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Limpiamos los objetivos
2. Enfocamos y ponemos las condiciones de diafragma abierto y luz cerrada
3. Colocar el aceite de inmersión, ya no se usa el tornillo macrométrico, solo el micrométrico para ajustar la imagen
4. Como la distancia en estos aumentos es mínima entre la preparación y el objetivo, tenemos que tener mucho cuidado de no romperla
5. Al terminar se limpia todo bien para que no quede aceite de inmersión

OBSERVACIONES

En nuestras preparaciones no observamos cromosomas en metafase.

Bandeo y Tinción de los Cromosomas

Una vez que hemos cultivado nuestras células, las hemos sometido a el proceso de el sacrificio y a una fijación, llega el momento de preparar la muestra para que sea observada, este será el objetivo de hoy.
Puesto que el Viernes no dio tiempo a hacer ningún lavado con fijador y guardemos nuestro tubo en el frigorífico con el carnoy, lo sacaremos y hoy continuaremos con los lavados que nos faltaron.

MATERIAL:

• Centrífuga
• Carnoy
• Tripsina
• Pipetas y prepipetas
• Pipetas pasteur
• Matraces
• Tinción giemsa
• Portaobjetos
• Funda para el portaobjetos
• Vasos de precipitado
• Solución tampón

PROCESO:

1. Centrifugamos nuestro tubo durante 5 min a 1000rpm.
2. Retiramos el sobrenadante.
3. Añadimos 1mL de carnoy, resuspendemos, y añadimos otros 4mL de carnoy, volvemos a resuspender.
4. El proceso de el punto 1 al 3 lo repetimos en cuatro ocasiones.
5. Una vez que hemos terminado los lavados, centrifugamos el tubo y retiramos sobrenadante, dejando 0.5mL, resuspendemos bien.
6. Mojamos el portaobjetos, limpio y correctamente, con agua fría.
7. Dejamos caer sobre el porta objetos 4 o 5 gotas con una pipeta pasteur  de la suspensión de núcleos a una distancia de 5-10 cm de altura en el centro de el porta y se deja resbalar la gota inclinando el porta para que extienda por toda la superficie 
8. Esperamos a que se seque. 
9. Mis compañeros prepararon la solución de bandeo, para ello la tripsina venia en una pastilla, la pastilla se disolvió en un litro de agua, aunque se disolvió en algo menos de el litro y luego se añadió el litro completo. De ahí se cogieron 40mL y se mezclaron con 40mL de buffer.
10. Sobre el papel de trabajo preparamos un vaso de precipitado con la tripsina, otro vaso de precipitado con solución tampón pH 6.8, un vaso con la tinción giemsa y otro con agua fría.
11. Se introduce en el vaso de tripsina el portaobjetos y inmediatamente después se introduce en el vaso de la solución tampón, luego en el vaso de la tinción giemsa durante dos min y después lo introducimos en agua fría.
12. Dejamos secar el porta objetos.

OBSERVACIONES:

En nuestro grupo pudimos hacer tres portaobjetos.

Sacrificio

Continuamos con el cariotipo en sangre periférica.
El objetivo de hoy es añadir la colchicina para poder para detener las células en mitosis, llevar a cabo el choque hipotónico para hinchar las células y se visualicen mejor los cromosomas más su consecuente fijación, el objetivo en principio fue después de fijar efectuar los lavados con el fijador y hacer las extensiones en el porta.

MATERIALES:

• Colchicina
• Estufa
• Centrífuga
• Tubos de centrífuga
• Pipetas pasteur
• 5mL de Cloruro Potásico
• Pipetas, prepipetas
• Fijador
• Cabina de flujo laminar
• Cubetas para desechos

PROCEDIMIENTO:

1. Sacamos nuestro tubo para el cariotipo de la incubadora y le añadimos 0.25 mL de colchicina, agitamos suavemente y dejamos en el incubador 45' a 37ºC.
2. Una vez pasados los 45 min, centrifugamos el tubo durante 5min a 1000rpm.
3. Con el tubo centrifugado eliminamos el sobrenadante con una pipeta pasteur, el sobrenadante lo iremos depositando en un bote de residuos.
4. Ahora procedemos al choque hipotónico, añadimos 1mL de Cloruro Potásico, mientras lo añadimos vamos mezclando a la vez
5. Resuspendemos para deshacer el tampón de pipeteo.
6. Luego añadimos otros 4mL en el tubo, y como antes mientras lo añadimos resuspendemos.
7. Centrifugamos durante 5' a 1000rpm, después eliminamos el sobrenadante.
8. Añadimos con una pipeta pasteur 1mL de fijador, se resuspende bien y despacio.
9. Ahora añadimos otros 4mL de fijador y resuspendemos.

OBSERVACIONES:

El protocolo seguiría con otra centrifugación y con la repetición de los pasos 8 y 9 con una centrifugación dos o tre veces hasta que se nos quede el tubo prácticamente transparente.

Además incluye las extensiones en el porta.

Por motivos de horarios de clase, no nos ha dado tiempo a incluir estos pasos hoy, así que hemos detenido el proceso en la fijación y hemos almacenado los tubos en un frigorífico.

Inicio en el Cariotipo en Sangre Periférica

El objetivo de esta practica es preparar la muestra de sangre para posteriormente poder elaborar un cariotipo.

MATERIALES:

• Gradilla
• Toallitas desinfectantes
• Lancetas
• Capilares
• Baño termoestático
• Medio de cultivo
• Pipeta de 0.25ml y sus puntas
• Fitohemaglutinina 
• Incubador de CO2
• 0.4ml de sangre

PROCEDIMIENTO:

1. El medio de cultivo (7ml), que hemos identificado, se encuentra congelado por lo que lo introducimos en el baño termoestático a 30º, también introduciremos un tubo de fitohemaglutinina que usaremos toda lal clase de el cual cada grupo extraemos 0.25ml, los necesarios para para preparar nuestra muestra.
2. Después de la descongelación homogeneizamos tanto el medio de cultivo como la fitohemaglutinina.
3. Extraemos la sangre, realizamos dos punciones con la lanceta en los dos dedos corazón. La sangre que va saliendo la introducimos en 4 capilares que en total sumarán 0.4ml de sangre.
4. Añadimos los 0.25 de fitohemaglutinina a el medio de cultivo, antes de añadir la sangre.
5. A continuación agitamos la sangre y le añadimos 0.4ml de sangre a el medio de cultivo.
6. Volvemos a agitar nuestro tubo y lo introducimos en el incubador de CO2 a 37º por 72h y ligeramente abierto.

OBSERVACIONES:

En nuestro cultivo hubo un error en el procedimiento, no se añadió primero la fitohemaglutinina, una lectina que induce la mitosis y la proliferación celular, si no que se introducieron 0.2ml de sangre, la fitohemaglutinina y los 0.2ml de sangre restantes.

Por otro lado también hay que mencionar que la incubación requiere de un periodo de 72 horas, pero por motivos de horarios de clase nuestras células serán incubadas durante 92 horas.