El objetivo de hoy es añadir la colchicina para poder para detener las células en mitosis, llevar a cabo el choque hipotónico para hinchar las células y se visualicen mejor los cromosomas más su consecuente fijación, el objetivo en principio fue después de fijar efectuar los lavados con el fijador y hacer las extensiones en el porta.
MATERIALES:
- Colchicina
- Estufa
- Centrífuga
- Tubos de centrífuga
- Pipetas pasteur
- 5mL de Cloruro Potásico
- Pipetas, prepipetas
- Fijador
- Cabina de flujo laminar
- Cubetas para desechos
PROCEDIMIENTO:
- Sacamos nuestro tubo para el cariotipo de la incubadora y le añadimos 0.25 mL de colchicina, agitamos suavemente y dejamos en el incubador 45' a 37ºC.
- Una vez pasados los 45 min, centrifugamos el tubo durante 5min a 1000rpm.
- Con el tubo centrifugado eliminamos el sobrenadante con una pipeta pasteur, el sobrenadante lo iremos depositando en un bote de residuos.
- Ahora procedemos al choque hipotónico, añadimos 1mL de Cloruro Potásico, mientras lo añadimos vamos mezclando a la vez
- Resuspendemos para deshacer el tampón de pipeteo.
- Luego añadimos otros 4mL en el tubo, y como antes mientras lo añadimos resuspendemos.
- Centrifugamos durante 5' a 1000rpm, después eliminamos el sobrenadante.
- Añadimos con una pipeta pasteur 1mL de fijador, se resuspende bien y despacio.
- Ahora añadimos otros 4mL de fijador y resuspendemos.
OBSERVACIONES:
El protocolo seguiría con otra centrifugación y con la repetición de los pasos 8 y 9 con una centrifugación dos o tre veces hasta que se nos quede el tubo prácticamente transparente.
Además incluye las extensiones en el porta.
Por motivos de horarios de clase, no nos ha dado tiempo a incluir estos pasos hoy, así que hemos detenido el proceso en la fijación y hemos almacenado los tubos en un frigorífico.
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