Criopreservación Hibridomas

En la práctica anterior calculemos cual era la viabilidad de nuestro cultivo y el número de crioviales que nos hacían falta para congelar nuestro cultivo de hibridomas.

El objetivo de la práctica no es otro que la criopresevación de hibridomas.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Control de Cultivo de Hibridomas

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando la evolución de nuestro cultivo de hibridomas.

Realizamos exactamente el mismo procedimiento de el día anterior, aunque esta vez no se le renueva el medio a las células, este conteo que realizaremos hoy nos servirá para la congelación que realizaremos este Viernes.

Tinción de Azul Tripán en Hibridomas

El objetivo de esta práctica es hacer un control sobre la situación en la que se encuentra nuestro cultivo de células hídridas.
Para ello realizaremos una tinción de azul tripán como para las células de insecto.

MATERIALES:

•  Nuestro T25
• Azul Tripán
• Cámara de recuento celular 
• Microscopio
• Tubo ependorff.
• Micropipeta

PROCEDIMIENTO:

1. Cogemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán.

7. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

8.Las observamos a el microscopio y realizamos el conteo.

9.Por otro lado retiramos el sobrenadante de nuestro cultivo y añadimos medio fresco, de la misma manera que lo hicimos con nuestro cultivo de células de insecto, y de igual forma lo introducimos de nuevo en la centrífuga.

Cultivo de Hibridomas

Los hibridomas son líneas celulares resultantes de la fusión de dos tipos celulares: un linfocito B y una línea celular derivada de un tumor de linfocitos B, se obtiene como resultado una mezcla heterogénea de células híbridas, seleccionándose a partir de ellas aquellas células con la capacidad de producir el anticuerpo deseado y de proliferar indefinidamente.
El objetivo de esta práctica es iniciarnos en el cultivo de los hidridomas.

MATERIAL:

• Kitasato y goma de vacio
• PBS (Suero Fetal Bovino), que será nuestro medio de cultivo
• Hibridomas en suspensión
• Pipetas y prepipetas 
• T25
• Incubador
• Gradillas
• Rotulador permanente

PROCEDIMIENTO:

1. Filtramos el medio de cultivo (PBS) en un ambientes estéril a través de un kitasato, dentro de la cabina, con un filtro de 20 micras.
2. Alicuotamos 8 ml de medio de cultivo, que es el que tendrá cada grupo de prácticas.
3. De los 8 ml de medio introducimos 4ml en un T25 y lo identificamos correctamente.
4. A continuación introducimos 1 ml de células en suspensión.
5. Cerramos nuestro T25 lo sacamos de la cabina y lo introducimos en el incubador, una vez dentro abrimos el T25 parcialmente.

Criopreservación Células de Insecto

Antes de proceder a congelar nuestras células tenemos que realizar una tinción de azul tripán, como anteriormente, para calcular la viabilidad de nuestras células y el numero de crioviales  que necesitaremos para congelarlas, pero en la práctica de hoy nos centraremos en la criopreservación como tal.

El objetivo de esta práctica es aprender a mantener nuestras células a través de la criopreservación.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• PBS
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO+PBS necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Continuamos el Control de el Cultivo

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando como evoluciona nuestro cultivo, de la misma forma que hemos ido haciendo días atrás.

Control de el Cultivo y Cambio de Medio

En esta práctica realizamos un cambio de medio para retirar las sustancias de desecho de las células y para añadir a nuestro T25 medio fresco, a la vez que observamos el cultivo.

MATERIAL:

• Tubo para cultivo T25
• Pipetas.
• Microscopio invertido.
• Tubo falcon.

PROCEDIMIENTO:

1.Observamos en el microscopio invertido la situación en la que se encuentra nuestro cultivo.

2.Pasamos los 5 ml de medio a un tubo de centrífuga y lo centrifugamos durante 8 min.

3.Después retiramos sobrenadante y añadimos medio fresco hasta llegar a 5 ml.
4.Lo pasamos a el T25 y lo metemos en el incubador, una vez dentro lo abrimos parcialmente.

Recuento de Células

El objetivo de la practica de hoy es entender como se procede a contar células en una cámara de neubauer para poder aplicarlo posteriormente en nuestras prácticas de cultivos celulares.

MATERIALES:

•  Frasco celular T25. 
• Azul Tripán. 
• Cámara de recuento celular. 
• Microscopio.
• Tubo ependorff.
• Micropipeta de 10µl

PROCEDIMIENTO:

1. Cojemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán. El azul es un colorante que mancha las células muertas y no las células vivas. 

5. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo tocando el fondo del tubo.

6. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

7.Un aspecto muy a tener en cuenta a la hora de observar las células para el contaje no puede ser otro que el manejo de el microscopio para poder visualizarlas lo mejor posible, a la hora de visionar las células tenemos que tener en cuenta:

• El microscopio a de estar al 10x10, es decir 10 en ocular y al 10 de objetivo
• El diafragma medio cerrado
• El condensador bajado, no debe emitir mucha luz sobre nuestra muestra, ya que el calor de esta podría afectarle
  

La imagen representa más o menos que nos encontraremos al observar nuestra cámara de neubauer y las flechas la dirección al contar las células, esta imagen muestra un cuadro de los cuatro que podemos contar en la cámara. 
9.Una vez contados nuestros cuadros pasaríamos a calcular la concentración de células/ml.

Técnica Aséptica

Pronto empezaremos a trabajar el cultivo de células y para ello es imprescindible trabajar preservando la asepsia, todos los materiales y superficies que entren en contacto con el cultivo deben permanecer estériles.

PARA REALIZAR LA TÉCNICA ASÉPTICA:

1. Pulverizamos la superficie en la que vamos a trabajar con etanol al 70%. 
2. Cogemos los componentes del medio de cultivo de la nevera o congelador, los botes de muestra o tubos con etanol al 70%, solo cogemos lo que necesitamos. 
4. Ordenamos la zona de trabajo para no tener que levantarse, evitamos que hayan muchas cosas en la mesa por que aumenta el riesgo de contaminación de la pipeta. 
5. Limpiamos cualquier vertido con etanol al 70% para minimizar la contaminación del medio de cultivo. 
6. Para terminar, eliminamos los restos de las soluciones manteniendo sólo las botellas que sean necesarias. 

Higiene personal:

1. Nos recogemos el pelo y hablamos lo mínimo. 
2. Rociamos los guantes desechables con etanol al 70%. 

Pipeteado y uso de reactivos:

1. Usamos dispensador de plástico estériles (puntas desechables) de 10 y 25 ml. 
2. No dejamos el bote en vertical pero tampoco en un ángulo que permita el derrame del contenido.
3. No dejamos el reactivo abierto y no trabajamos sobre el bote abierto. 
4. El frasco de cultivo debería estar fijado horizontalmente cuando está abierto y mantener el ángulo durante su manipulación. 
Al finalizar la práctica retiramos todas las pipetas, frascos, etc. utilizadas y no utilizadas de la mesa de trabajo y limpiamos con etanol al 70% toda la superficie, guardamos todos los reactivos a la nevera o congelador. 

Alicuotar el Medio

A través de esta practica comenzamos nuestro cultivo celular de células de insecto, y por lo tanto a adquirir conocimientos ya aplicados sobre como hacerlo.

LOS MATERIALES:

• Recipiente para desechos en la cabina
• Etanol 70% en botellas de aerosol. 
• Pipeta automática y pipetas con perilla.
• Rotulador permanente.
• Guantes desechables de laboratorio. 
• Tubos de fondo cónico de 50 ml (estériles).
• Frasco cultivo celular (estéril, 25 cm2 ) (T-25).
• Medio de cultivo de células de insecto. 
• Medio fresco 

PROCEDIMIENTO:

Para comenzar limpiamos, como ya hemos echo en una anterior práctica, adecuadamente nuestra cabina de flujo laminar.
Una vez preparada la cabina y los materiales dentro de ella nos turnamos y vamos realizando de forma aséptica el repartir 20 ml de medio de células del insecto en 6 tubos de 50 ml. Cada grupo tendrá su tubo.

Tomamos de el tubo falcon 4 ml (medio de cultivo) y se lo añadimos a un frasco T25 esteril, después le añadimos 1 ml de células de insecto en suspensión , lo cerramos y lo rotulamos por el lateral indicando que son células de insecto y el grupo al que pertenecen.
Comprobamos que el T25 esté cerrado antes de sacarlo de la cabina y lo introducimos en un incubador, una vez dentro dejamos el tapón medio abierto y cerramos el incubador.

Después de la práctica dejamos ordenado y limpio el laboratorio.