Control de el Cultivo y Cambio de Medio

En esta práctica realizamos un cambio de medio para retirar las sustancias de desecho de las células y para añadir a nuestro T25 medio fresco, a la vez que observamos el cultivo.

MATERIAL:

• Tubo para cultivo T25
• Pipetas.
• Microscopio invertido.
• Tubo falcon.

PROCEDIMIENTO:

1.Observamos en el microscopio invertido la situación en la que se encuentra nuestro cultivo.

2.Pasamos los 5 ml de medio a un tubo de centrífuga y lo centrifugamos durante 8 min.

3.Después retiramos sobrenadante y añadimos medio fresco hasta llegar a 5 ml.
4.Lo pasamos a el T25 y lo metemos en el incubador, una vez dentro lo abrimos parcialmente.

Recuento de Células

El objetivo de la practica de hoy es entender como se procede a contar células en una cámara de neubauer para poder aplicarlo posteriormente en nuestras prácticas de cultivos celulares.

MATERIALES:

•  Frasco celular T25. 
• Azul Tripán. 
• Cámara de recuento celular. 
• Microscopio.
• Tubo ependorff.
• Micropipeta de 10µl

PROCEDIMIENTO:

1. Cojemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán. El azul es un colorante que mancha las células muertas y no las células vivas. 

5. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo tocando el fondo del tubo.

6. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

7.Un aspecto muy a tener en cuenta a la hora de observar las células para el contaje no puede ser otro que el manejo de el microscopio para poder visualizarlas lo mejor posible, a la hora de visionar las células tenemos que tener en cuenta:

• El microscopio a de estar al 10x10, es decir 10 en ocular y al 10 de objetivo
• El diafragma medio cerrado
• El condensador bajado, no debe emitir mucha luz sobre nuestra muestra, ya que el calor de esta podría afectarle
  

La imagen representa más o menos que nos encontraremos al observar nuestra cámara de neubauer y las flechas la dirección al contar las células, esta imagen muestra un cuadro de los cuatro que podemos contar en la cámara. 
9.Una vez contados nuestros cuadros pasaríamos a calcular la concentración de células/ml.

Técnica Aséptica

Pronto empezaremos a trabajar el cultivo de células y para ello es imprescindible trabajar preservando la asepsia, todos los materiales y superficies que entren en contacto con el cultivo deben permanecer estériles.

PARA REALIZAR LA TÉCNICA ASÉPTICA:

1. Pulverizamos la superficie en la que vamos a trabajar con etanol al 70%. 
2. Cogemos los componentes del medio de cultivo de la nevera o congelador, los botes de muestra o tubos con etanol al 70%, solo cogemos lo que necesitamos. 
4. Ordenamos la zona de trabajo para no tener que levantarse, evitamos que hayan muchas cosas en la mesa por que aumenta el riesgo de contaminación de la pipeta. 
5. Limpiamos cualquier vertido con etanol al 70% para minimizar la contaminación del medio de cultivo. 
6. Para terminar, eliminamos los restos de las soluciones manteniendo sólo las botellas que sean necesarias. 

Higiene personal:

1. Nos recogemos el pelo y hablamos lo mínimo. 
2. Rociamos los guantes desechables con etanol al 70%. 

Pipeteado y uso de reactivos:

1. Usamos dispensador de plástico estériles (puntas desechables) de 10 y 25 ml. 
2. No dejamos el bote en vertical pero tampoco en un ángulo que permita el derrame del contenido.
3. No dejamos el reactivo abierto y no trabajamos sobre el bote abierto. 
4. El frasco de cultivo debería estar fijado horizontalmente cuando está abierto y mantener el ángulo durante su manipulación. 
Al finalizar la práctica retiramos todas las pipetas, frascos, etc. utilizadas y no utilizadas de la mesa de trabajo y limpiamos con etanol al 70% toda la superficie, guardamos todos los reactivos a la nevera o congelador. 

Alicuotar el Medio

A través de esta practica comenzamos nuestro cultivo celular de células de insecto, y por lo tanto a adquirir conocimientos ya aplicados sobre como hacerlo.

LOS MATERIALES:

• Recipiente para desechos en la cabina
• Etanol 70% en botellas de aerosol. 
• Pipeta automática y pipetas con perilla.
• Rotulador permanente.
• Guantes desechables de laboratorio. 
• Tubos de fondo cónico de 50 ml (estériles).
• Frasco cultivo celular (estéril, 25 cm2 ) (T-25).
• Medio de cultivo de células de insecto. 
• Medio fresco 

PROCEDIMIENTO:

Para comenzar limpiamos, como ya hemos echo en una anterior práctica, adecuadamente nuestra cabina de flujo laminar.
Una vez preparada la cabina y los materiales dentro de ella nos turnamos y vamos realizando de forma aséptica el repartir 20 ml de medio de células del insecto en 6 tubos de 50 ml. Cada grupo tendrá su tubo.

Tomamos de el tubo falcon 4 ml (medio de cultivo) y se lo añadimos a un frasco T25 esteril, después le añadimos 1 ml de células de insecto en suspensión , lo cerramos y lo rotulamos por el lateral indicando que son células de insecto y el grupo al que pertenecen.
Comprobamos que el T25 esté cerrado antes de sacarlo de la cabina y lo introducimos en un incubador, una vez dentro dejamos el tapón medio abierto y cerramos el incubador.

Después de la práctica dejamos ordenado y limpio el laboratorio.

¿Sal, Detergente, Alcohol?

La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más facilmente del ADN.

El detergente (O gel o champú) utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo que estamos utilizando; el detergente disuelve las grasas, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior. 

El ADN es una molécula muy larga y tiende agruparse. De ahí la facilidad para retirarla. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Gracias a las propiedades de estas sustancias tan comunes que podemos encontrar por casa es posible hacer una extracción de ADN casera.

Extracción Casera de ADN de la Mucosa Bucal

La técnica que vamos a poner en práctica hoy nos recordará mucho a la anterior de 
laboratorioclinicoybiomediconuria.blogspot.com.es/2016/10/extraccion-casera-de-adn-vegetal.html
Esto se debe a que ambos se rigen por el mismo fundamento el cual explicaré en la siguiente entrada de el blog.
De momento nos centraremos en cómo hemos extraido de forma casera el ADN de nuestra mucosa bucal.
El ADN procede de las células de descamación del epitelio mucoso del interior de la boca. 

MATERIAL 

• Agua destilada o mineral 
• Alcohol de 96º muy frío 
• Un asa de siembra 
• Sal común 
• Detergente lavavajillas 
• Vasos desechables 
• Tubo de ensayo 
• Gradilla 
• Tubos eppendorf 
• Alcohol de 70º Procedimiento. 
• Azul de metileno

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos un tubo de ensayo con alcohol etílico de 96 º
2. Ponemos un poco de agua en un vaso y nos enjuagamos la boca enérgicamente durante al menos medio minuto para arrastrar el mayor número posible de células de descamación de la mucosa bucal, antes de hacerlo tragamos saliva para eliminar la acción de los enzimas contenidos en ella.
3. Colocamos unos 20 ml de agua destilada con dos pizcas de sal, en otro vaso y un par de gotas de detergente lavavajillas. 
4. Expulsamos el agua en el vaso de precipitados sobre la solución anterior y dejamos actuar durante unos 10 minutos, removiendo de vez en cuando suavemente para disolver estos componentes evitando la formación de espuma. 
5. A continuación, añadimos la solución suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol muy frío dejándola resbalar por la pared del tubo inclinado. 
6. La dejamos reposar durante 2 ó 3 min
   utos sin moverlo en absoluto. 
7. Tras estos minutos de reposo, el ADN sube hacia la superficie de el alcohol.
8. Entonces lo recogemos con un asa de siembra enrrollando la ''gelatina'' que forma el ADNsuavemente. 
9. Finalmente suspendemos el ADN extraído en un eppendorf con Alcohol de 70º
10. Y en nuestro caso ponemos una gotita de azul de metileno en el ependorff para visualizarlo.

Extracción Casera de ADN Vegetal

Con este método casero se puede extraer el ADN de diversos tipos de frutas y verduras, en nuestro caso el de un plátano.
      Necesitaremos

• 50g de plátano
• Batidora de mano
• Matraz
• Filtro tipo cafetera
• Embudo para filtrar
• Alcohol 96º muy frío
• Pipeta Pasteur
• Tubo de ensayo
• Gradilla
• Vaso para batir
• Agua destilada
• Espátula
• Vaso de precipitados
• Detergente tipo lavavajillas
• Un poco de sal común

    Procedimiento

1.  Batimos el plátano en 250 ml de agua destilada o en su defecto mineral, nunca de el grifo, durante 15 a 20 segundos hasta obtener una papilla homogénea. 
2. Preparamos un tubo de ensayo por cada extracción con alcohol etílico y poner a enfriar en la nevera.
3. Por otra parte, en un vaso de precipitado pequeño se mezclamos una cucharada de champú o lavavajillas líquido con dos pizcas de sal de mesa y 20 ml de Agua destilada. 
4. Añadimos tres cucharadas del puré de plátano a la mezcla de lavavajillas, sal y agua. 
5. Removemos durante 5-10 minutos, con cuidado de no formar mucha espuma.
6. Para eliminar los restos tisulares y celulares, dejamos filtrar la solución durante varios minutos en papel de filtro, filtro de cafetera o un paño de algodón suave, hasta obtener aproximadamente 5 ml de filtrado. 
7. Tomamos el filtrado y añadimos en el tubo de ensayo que contiene el alcohol frio, resbalando por las paredes. Dejar reposar durante 2 ó 3 minutos sin moverlo en absoluto.
8. Después extraemos la especie de ''gelatina'' que se nos debe de haber formado en el tubo de ensayo, y lo introducimos en un tubo enpendorff, que tenemos preparado con alcohol 70º frío, con una varilla. Para visualizar el ADN lo teñimos con una gotita de Azul de metileno.