Continuamos con la Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Continuamos la práctica anterior.

MATERIALES

• 5 μL de producto de PCR
• 5μL Tampón de carga
• Agua de biología molecular
• Marcador de peso molecular
• Tampón de electroforesis
• Cubeta electroforesis
•  Gel electroforesis

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la muestra con 5 μL de nuestro producto de PCR, 5μL de tampón de carga y 10 μL de agua de biología molecular, y resuspendemos
2. Por cada peine, en nuestro caso dos, 4 μL de marcador de peso molecular, 5 μL de tampón de carga y 11 μL de agua de biología molecular
3. Llenamos la cubeta con tampón de electroforesis e introducimos el gel 
4. Procedemos a insertar nuestras muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación del gel 
5. Conectamos la cubeta a la fuente a un voltaje constante 35 min 
6. Visualizamos en el transiluminador 

OBSERVACIONES

Hay que prestar mucha atención ha no mover la cubeta de la electroforesis por que el gel que queda adherido puede despegarse y dificultar la carga de las muestras en los pocillos del gel.

Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Con esta práctica usamos nuestros conocimientos sobre PCR y electroforesis aplicados a la detección de la mutación de la trombosis buscando genes asociados a distintos factores de la coagulación.

MATERIALES

• Eppendorff
• Agua ultrapura
• Muestra ADN
• Tampón 5x
• Primers F y R 
• Taq polimerasa

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos a un tubo eppendorff 13,6 μL de agua ultrapura
2. Pipeteamos 5 μL de ADN y 5 μL de tampón 5x
3. Agregamos 0.5 μL de Primer R y 0.5 μL de Primers F
4. Añadimos 0.4 μL de Taq polimerasa, es lo últimpo que haremos para que no empiece su actividad hasta que esté todo en el tubo eppendorff
5. Ponemos en el termociclador el programa adecuado 

OBSERVACIONES

Al día siguiente continuaremos la practica preparándola para visualizarla en un transiluminador.

Determinación de la Pureza del ADN : Espectrofotómetro

OBJETIVO

Aprender a usar el espectrofotómetro y medir la pureza de nuestro ADN genómico de la anterior práctica.

MATERIALES

• ADN genómico
• Tris HCl (pH 8)
• EDTA 0.001M

PROCEDIMIENTO

1. Encendemos el espectofotómetro 10-20 minutos antes de empezar a medir 
2. Preparamos 4 mL TE, mezclando 2 mL de EDTA y 2 mL de agua destilada
3. Añadimos en un tubo de ensayo 1 mL de TE, más 50 μL de muestra de ADN purificada y resuspender y por último 1.45 mL más de TBE y mezclar
4. Colocar el espectrofotómetro a una λ=260 nm
5. Ponemos ''el blanco'' con tampón de TBE en una cubeta, esto sirve para no tener en cuenta la absorbancia que no sea de ADN 
6. Medimos la dilución del punto 3
7. Anotamos la absorbancia 
8. Sacamos la muestra del espectofotómetro
9. Modificamos la absorbancia a una λ= 280 nm
10. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
11. Modificamos la absorbancia a una λ= 230 nm
12. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
13. Realizamos los cálculos pertinentes para determinar la pureza

OBSERVACIONES

No tocar las paredes que debe de atravesar la luz en la cubeta y también vigilar que esta no esté rallada.

Continuamos con la Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO 

Continuamos con la práctica del lunes, para ello necesitaremos los materiales del día anterior.

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 500 μL de Tampón de deshinibición en el nuevo tubo de recolección, centrifugamos 12000-14000 rpm durante 60 segundos y eleminanos el líquido
2. Añadimos 500 μL de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna y centrifugamos a 12000 rpm durante 60 segundos y eleminamos el líquido
3. Hacemos un segundo lavado, de nuevo otros 500 μL de Tampón de Lavado, centrifugamos a 14000 rpm durante 60 segundos y volvemos a retirar el liquido
4. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos y eliminamos el alcohol residual
5. Eliminamos  el tubo de recogida y ponemos un eppendorff, añadimos 200 μL de Tampón de Elución precalentado a 70ºC e incubamos 1 minuto a temperatura ambiente
6. Por último centriffugamos a máxima velocidad durante 60 segundos y ya tenemos el ADN genómico en nuestro tubo eppendorff

OBSERVACIONES

El riesgo que tiene hacer esta práctica en dos partes es por ejemplo que el dejar el etanol, sin hacer los lavados pertinentes, durante tanto tiempo con nuestro ADN puede dañarlo, por eso lo ideal es llevar a cabo esta práctica de una vez, cosa que no hemos podido llevar a cabo por los horarios de clase.

Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO

Aprender a obtener una rápida extracción y purificación de ADN genómico de alta calidad a partir de sangre total utilizando Spin columnas con membrana de silica que une selectivamente el ADN

MATERIALES

• 900 μL Tampón de Lisis
• 300 μL de sangre total
• 180 μLTampón de Lisis de Tejidos
• 25 μL de Proteinasa K 
• 200 μL Tampón de Lisis/unión
• 200 μL etanol
• MicroSpin columna y varios tubos de recolección 
• 500 μL Tampón de Deshinibición
• 1 mL Tampón de Lavado
•  200 μL Tampón Elución 
• Tubos eppendorff

PROCEDIMIENTO

1. Pipeteamos 300 μL de sangre en un microtubo de 1.5 mL y añadimos 900 μL de Tampón de Lisis, mezclándolo con un vortex e incubándolo 10 minutos a temperatura ambiente
2. Se centrifuga a la máxima potencia durante un minuto y quitamos el sobrenadante por decantación, dejando 10μL-20 de líquido residual y después vortex
3. Añadimos 180 μL de Tampón de Lisis de Tejidos más 25 μL de Proteinasa K y mezclamos con un votex 2 o 5 segundos
4. Incubar a 56ºC durante 10 minutos 
5. Añadimos 200 μL de Tampón de Lisis/unión, mezclamos con vortex e incubamos a 70ºC durante 10 minutos
6. Añadimos 200 μL de Etanol (96%-100%) y mezclamos con vortex
7. Ahora lo pasamos a MicroSpin columna 
8. Centrifugamos a 8000 rpm durante 60 segundos eliminamos el tubo y ponemos un nuevo tubo de recolección  

OBSERVACIONES

El protocolo no acaba aquí pero en nuestro caso lo continuaremos al día siguiente, quedándonos en el paso 8.

Electroforesis

OBJETIVO

Aprender a realizar una electroforesis

MATERIAL

• Tampón de electroforesis
• Gel de electroforesis
• Cubeta de electroforesis
• Escalera de muestras
• Pipetas 5 μL

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta añadiendo el tampón de electroforesis y sumergimos el gel de agarosa grande que hicimos el día anterior
2. Vamos pipeteando 5μL de las escaleras de muestras en los pocillos del gel 
3. Conectamos la cubeta a la corriente a un voltaje constante de 130 V durante 35 min
4. Desconectar de la fuente
5. Sacamos el gel de la cubeta lo secamos cuidadosamente y lo colocamos en el transiluminador UV para observar los resultados