Criopreservación Hibridomas

En la práctica anterior calculemos cual era la viabilidad de nuestro cultivo y el número de crioviales que nos hacían falta para congelar nuestro cultivo de hibridomas.

El objetivo de la práctica no es otro que la criopresevación de hibridomas.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Control de Cultivo de Hibridomas

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando la evolución de nuestro cultivo de hibridomas.

Realizamos exactamente el mismo procedimiento de el día anterior, aunque esta vez no se le renueva el medio a las células, este conteo que realizaremos hoy nos servirá para la congelación que realizaremos este Viernes.

Tinción de Azul Tripán en Hibridomas

El objetivo de esta práctica es hacer un control sobre la situación en la que se encuentra nuestro cultivo de células hídridas.
Para ello realizaremos una tinción de azul tripán como para las células de insecto.

MATERIALES:

•  Nuestro T25
• Azul Tripán
• Cámara de recuento celular 
• Microscopio
• Tubo ependorff.
• Micropipeta

PROCEDIMIENTO:

1. Cogemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán.

7. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

8.Las observamos a el microscopio y realizamos el conteo.

9.Por otro lado retiramos el sobrenadante de nuestro cultivo y añadimos medio fresco, de la misma manera que lo hicimos con nuestro cultivo de células de insecto, y de igual forma lo introducimos de nuevo en la centrífuga.

Cultivo de Hibridomas

Los hibridomas son líneas celulares resultantes de la fusión de dos tipos celulares: un linfocito B y una línea celular derivada de un tumor de linfocitos B, se obtiene como resultado una mezcla heterogénea de células híbridas, seleccionándose a partir de ellas aquellas células con la capacidad de producir el anticuerpo deseado y de proliferar indefinidamente.
El objetivo de esta práctica es iniciarnos en el cultivo de los hidridomas.

MATERIAL:

• Kitasato y goma de vacio
• PBS (Suero Fetal Bovino), que será nuestro medio de cultivo
• Hibridomas en suspensión
• Pipetas y prepipetas 
• T25
• Incubador
• Gradillas
• Rotulador permanente

PROCEDIMIENTO:

1. Filtramos el medio de cultivo (PBS) en un ambientes estéril a través de un kitasato, dentro de la cabina, con un filtro de 20 micras.
2. Alicuotamos 8 ml de medio de cultivo, que es el que tendrá cada grupo de prácticas.
3. De los 8 ml de medio introducimos 4ml en un T25 y lo identificamos correctamente.
4. A continuación introducimos 1 ml de células en suspensión.
5. Cerramos nuestro T25 lo sacamos de la cabina y lo introducimos en el incubador, una vez dentro abrimos el T25 parcialmente.

Criopreservación Células de Insecto

Antes de proceder a congelar nuestras células tenemos que realizar una tinción de azul tripán, como anteriormente, para calcular la viabilidad de nuestras células y el numero de crioviales  que necesitaremos para congelarlas, pero en la práctica de hoy nos centraremos en la criopreservación como tal.

El objetivo de esta práctica es aprender a mantener nuestras células a través de la criopreservación.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• PBS
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO+PBS necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Continuamos el Control de el Cultivo

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando como evoluciona nuestro cultivo, de la misma forma que hemos ido haciendo días atrás.

Control de el Cultivo y Cambio de Medio

En esta práctica realizamos un cambio de medio para retirar las sustancias de desecho de las células y para añadir a nuestro T25 medio fresco, a la vez que observamos el cultivo.

MATERIAL:

• Tubo para cultivo T25
• Pipetas.
• Microscopio invertido.
• Tubo falcon.

PROCEDIMIENTO:

1.Observamos en el microscopio invertido la situación en la que se encuentra nuestro cultivo.

2.Pasamos los 5 ml de medio a un tubo de centrífuga y lo centrifugamos durante 8 min.

3.Después retiramos sobrenadante y añadimos medio fresco hasta llegar a 5 ml.
4.Lo pasamos a el T25 y lo metemos en el incubador, una vez dentro lo abrimos parcialmente.