Realización Electroforesis (Rh)

OBJETIVO

Seguimos con la practica para la determinación del Rh, ya tenemos preparadas las muestras directas para realizar la elecreoforesis.

MATERIALES

• Muestras de ADN
• Marcador de peso molecular
• Geles de Silver green y Dana green 
• Cubeta de electroforesis
• Controles negativo y positivo 
• TAE

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta colocando dos geles uno de Dana green y otro de Silver Green, con cuidado de que no se toquen, llenamos de TAE (tampón de electroforesis) la cubeta intentando que no se nos despeguen los geles
2. Procedemedos a cargar los geles, anotando siempre que estamos cargando y donde
3. Conectamos a la corriente los electrodos programamos el voltaje y tiempo de electroforesis

OBSERVACIONES

Al observar los resultados entendemos que o bien el tiempo de la electroforesis tenía que haber sido más largo o que el gel hubiese tenido una menos concentración, dado que la muestra a podido correr muy poco por el gel.

Determinación del Factor Rh por PCR

OBJETIVOS

Continuar aprendiendo sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el de la determinación del Rh, el factor Rh es una proteína integral de la membrana de los glóbulos rojos, positivos son aquellas personas que presentan dicha proteína en sus eritrocitos y negativa quienes no presenten la proteína. Esto es lo que vamos a determinar con esta prueba.Hoy prepararemos los geles donde posteriormente se hará la determinación y prepararemos las muestras y controles para llevar acabo la PCR.

Explicaré el crocedimiento de el gel de Dana Green, ya que el de Silver Green está en post anteriores.

MATERIAL

• Tubos de 0.2 mL
• Agarosa
• TBE 1x
• Mix PCR
• Agua de biología molecular
• ADN
• Control positivo
• Matraz Erlenmeyer
• DanaBlue 
• Agarosa

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL GEL CON DANA GREEN:

1. En un matraz Erlenmeyer de 100mL, añadimos 32 mL de tampón de electroforesis 1x más 0.60 gr de agarosa (2%)
2. Añadimos 80 μL de DanaBlue 0.1%, agitamos para disolver los grumos de agarosa.
3. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa llevándola a ebullición. La solución resultante tiene que aparecer clara, sin partículas aparentes.
4. Enfriamos la solución más o menos hasta 55%. 
5. Ponemos el peine en el molde y añadimos la mezcla cuidadosamente hasta que se enfríe del todo.
6. Lo sacamos del molde y lo guardamos hasta que los usemos para realizar la electroforesis.

PREPARACIÓN DEL LAS MUESTRAS DE PCR:

1. En el tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5 μL de Mix de PCR y 2.5 μL de agua de biología molecular, se mezcla bien. Este es el control negativo.
2. En otro tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de control positivo, mezclamos bien.
3. De nuevo en un tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de ADN, mezclamos bien.
4. Pasamos los tubos al termociclador. 

OBSERVACIONES

En el caso de de la preparación del gel las cantidades estaban dadas por el protocolo para geles de 7x7, pero en nuestro laboratorio no hay moldes de ese tamaño, si no más grandes, así que tuvimos que volver a hacer el protocolo como para otro gel, calentar la mezcla que teníamos y juntarlos para hacer un solo gel. El resultado fue bueno.

Extracción ADN de la Saliva

OBJETIVO

Extraer nuestro ADN para que lo podamos trabajar con él en la siguiente práctica.

MATERIALES

• Solución de Lisis
• Proteinasa K 
• Solución de Acetato de Sodio 
• Etanol absoluto
• Tubo ependorf
• Tubo de centrífuga
• Pipeta pasteur
• Asas de siembra
• Pipetas graduadas y puntas
• Agua de biología molecular

PROCEDIMIENTO 

1. Obtenemos la muestra de saliva, para ello nos enjuagamos antes con agua, luego nos rascamos un poco la mucosa bucal y la lengua con un asa de siembra para una mayor cantidad de ADN y nos enjuagamos con suero fisiológico.
2. Recogemos  10 mL de saliva con el suero fisiológico en un tubo cónico, nos ayudamos de un embudo.
3. Añadimos 1 mL de Solución de Lisis al tubo con la muestra.
4. Mezclamos por inversión.
5. Con la micropipeta añadimos 20 μL de Proteinasa K, para ello apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale.
6. Mezclamos por inversión.
7. Incubamos durante 10 minutos y agitamos cada 3 minutos.
8. Añadimos 200 μL de Acetato de Sodio, mezclamos por inversión.
9. Con una pipeta pasteur añadimos 3 mL de Etanol, que tiene que estar bien frío. Apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale lentamente.
10. Incubamos durante 2 min sin moverlo.
11. Mezclamos por inmersión muy lentamente.
12. Nos aparece una madeja de ADN que capturaremos con un asa de siembra y llevaremos a un eppendorf.
13. Para conservar el ADN para otro día llenamos el eppendorf con tampón de hidratación y metemos en el congelador.

OBSERVACIONES

Después de obtener la saliva con el suero fisiológico centrifugamos hasta obtener un pellet y después continuamos con el protocolo disolviendo el pellet todo lo posible por inversión, pero finalmente obtuvimos el ADN.

Continuamos con la Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Continuamos la práctica anterior.

MATERIALES

• 5 μL de producto de PCR
• 5μL Tampón de carga
• Agua de biología molecular
• Marcador de peso molecular
• Tampón de electroforesis
• Cubeta electroforesis
•  Gel electroforesis

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la muestra con 5 μL de nuestro producto de PCR, 5μL de tampón de carga y 10 μL de agua de biología molecular, y resuspendemos
2. Por cada peine, en nuestro caso dos, 4 μL de marcador de peso molecular, 5 μL de tampón de carga y 11 μL de agua de biología molecular
3. Llenamos la cubeta con tampón de electroforesis e introducimos el gel 
4. Procedemos a insertar nuestras muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación del gel 
5. Conectamos la cubeta a la fuente a un voltaje constante 35 min 
6. Visualizamos en el transiluminador 

OBSERVACIONES

Hay que prestar mucha atención ha no mover la cubeta de la electroforesis por que el gel que queda adherido puede despegarse y dificultar la carga de las muestras en los pocillos del gel.

Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Con esta práctica usamos nuestros conocimientos sobre PCR y electroforesis aplicados a la detección de la mutación de la trombosis buscando genes asociados a distintos factores de la coagulación.

MATERIALES

• Eppendorff
• Agua ultrapura
• Muestra ADN
• Tampón 5x
• Primers F y R 
• Taq polimerasa

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos a un tubo eppendorff 13,6 μL de agua ultrapura
2. Pipeteamos 5 μL de ADN y 5 μL de tampón 5x
3. Agregamos 0.5 μL de Primer R y 0.5 μL de Primers F
4. Añadimos 0.4 μL de Taq polimerasa, es lo últimpo que haremos para que no empiece su actividad hasta que esté todo en el tubo eppendorff
5. Ponemos en el termociclador el programa adecuado 

OBSERVACIONES

Al día siguiente continuaremos la practica preparándola para visualizarla en un transiluminador.

Determinación de la Pureza del ADN : Espectrofotómetro

OBJETIVO

Aprender a usar el espectrofotómetro y medir la pureza de nuestro ADN genómico de la anterior práctica.

MATERIALES

• ADN genómico
• Tris HCl (pH 8)
• EDTA 0.001M

PROCEDIMIENTO

1. Encendemos el espectofotómetro 10-20 minutos antes de empezar a medir 
2. Preparamos 4 mL TE, mezclando 2 mL de EDTA y 2 mL de agua destilada
3. Añadimos en un tubo de ensayo 1 mL de TE, más 50 μL de muestra de ADN purificada y resuspender y por último 1.45 mL más de TBE y mezclar
4. Colocar el espectrofotómetro a una λ=260 nm
5. Ponemos ''el blanco'' con tampón de TBE en una cubeta, esto sirve para no tener en cuenta la absorbancia que no sea de ADN 
6. Medimos la dilución del punto 3
7. Anotamos la absorbancia 
8. Sacamos la muestra del espectofotómetro
9. Modificamos la absorbancia a una λ= 280 nm
10. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
11. Modificamos la absorbancia a una λ= 230 nm
12. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
13. Realizamos los cálculos pertinentes para determinar la pureza

OBSERVACIONES

No tocar las paredes que debe de atravesar la luz en la cubeta y también vigilar que esta no esté rallada.

Continuamos con la Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO 

Continuamos con la práctica del lunes, para ello necesitaremos los materiales del día anterior.

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 500 μL de Tampón de deshinibición en el nuevo tubo de recolección, centrifugamos 12000-14000 rpm durante 60 segundos y eleminanos el líquido
2. Añadimos 500 μL de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna y centrifugamos a 12000 rpm durante 60 segundos y eleminamos el líquido
3. Hacemos un segundo lavado, de nuevo otros 500 μL de Tampón de Lavado, centrifugamos a 14000 rpm durante 60 segundos y volvemos a retirar el liquido
4. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos y eliminamos el alcohol residual
5. Eliminamos  el tubo de recogida y ponemos un eppendorff, añadimos 200 μL de Tampón de Elución precalentado a 70ºC e incubamos 1 minuto a temperatura ambiente
6. Por último centriffugamos a máxima velocidad durante 60 segundos y ya tenemos el ADN genómico en nuestro tubo eppendorff

OBSERVACIONES

El riesgo que tiene hacer esta práctica en dos partes es por ejemplo que el dejar el etanol, sin hacer los lavados pertinentes, durante tanto tiempo con nuestro ADN puede dañarlo, por eso lo ideal es llevar a cabo esta práctica de una vez, cosa que no hemos podido llevar a cabo por los horarios de clase.