Continuamos con la Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO 

Continuamos con la práctica del lunes, para ello necesitaremos los materiales del día anterior.

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 500 μL de Tampón de deshinibición en el nuevo tubo de recolección, centrifugamos 12000-14000 rpm durante 60 segundos y eleminanos el líquido
2. Añadimos 500 μL de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna y centrifugamos a 12000 rpm durante 60 segundos y eleminamos el líquido
3. Hacemos un segundo lavado, de nuevo otros 500 μL de Tampón de Lavado, centrifugamos a 14000 rpm durante 60 segundos y volvemos a retirar el liquido
4. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos y eliminamos el alcohol residual
5. Eliminamos  el tubo de recogida y ponemos un eppendorff, añadimos 200 μL de Tampón de Elución precalentado a 70ºC e incubamos 1 minuto a temperatura ambiente
6. Por último centriffugamos a máxima velocidad durante 60 segundos y ya tenemos el ADN genómico en nuestro tubo eppendorff

OBSERVACIONES

El riesgo que tiene hacer esta práctica en dos partes es por ejemplo que el dejar el etanol, sin hacer los lavados pertinentes, durante tanto tiempo con nuestro ADN puede dañarlo, por eso lo ideal es llevar a cabo esta práctica de una vez, cosa que no hemos podido llevar a cabo por los horarios de clase.

Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO

Aprender a obtener una rápida extracción y purificación de ADN genómico de alta calidad a partir de sangre total utilizando Spin columnas con membrana de silica que une selectivamente el ADN

MATERIALES

• 900 μL Tampón de Lisis
• 300 μL de sangre total
• 180 μLTampón de Lisis de Tejidos
• 25 μL de Proteinasa K 
• 200 μL Tampón de Lisis/unión
• 200 μL etanol
• MicroSpin columna y varios tubos de recolección 
• 500 μL Tampón de Deshinibición
• 1 mL Tampón de Lavado
•  200 μL Tampón Elución 
• Tubos eppendorff

PROCEDIMIENTO

1. Pipeteamos 300 μL de sangre en un microtubo de 1.5 mL y añadimos 900 μL de Tampón de Lisis, mezclándolo con un vortex e incubándolo 10 minutos a temperatura ambiente
2. Se centrifuga a la máxima potencia durante un minuto y quitamos el sobrenadante por decantación, dejando 10μL-20 de líquido residual y después vortex
3. Añadimos 180 μL de Tampón de Lisis de Tejidos más 25 μL de Proteinasa K y mezclamos con un votex 2 o 5 segundos
4. Incubar a 56ºC durante 10 minutos 
5. Añadimos 200 μL de Tampón de Lisis/unión, mezclamos con vortex e incubamos a 70ºC durante 10 minutos
6. Añadimos 200 μL de Etanol (96%-100%) y mezclamos con vortex
7. Ahora lo pasamos a MicroSpin columna 
8. Centrifugamos a 8000 rpm durante 60 segundos eliminamos el tubo y ponemos un nuevo tubo de recolección  

OBSERVACIONES

El protocolo no acaba aquí pero en nuestro caso lo continuaremos al día siguiente, quedándonos en el paso 8.

Electroforesis

OBJETIVO

Aprender a realizar una electroforesis

MATERIAL

• Tampón de electroforesis
• Gel de electroforesis
• Cubeta de electroforesis
• Escalera de muestras
• Pipetas 5 μL

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta añadiendo el tampón de electroforesis y sumergimos el gel de agarosa grande que hicimos el día anterior
2. Vamos pipeteando 5μL de las escaleras de muestras en los pocillos del gel 
3. Conectamos la cubeta a la corriente a un voltaje constante de 130 V durante 35 min
4. Desconectar de la fuente
5. Sacamos el gel de la cubeta lo secamos cuidadosamente y lo colocamos en el transiluminador UV para observar los resultados

Preparación del Gel de Agarosa y Tampón de Electroforesis

OBJETIVO

Preparar los reactivos (gel de agarosa y tampón de electroforesis) para poder llevar a cabo una electroforesis.

MATERIALES

• Bandeja con peine
• Agarosa
• TBE 10x
• TBE 1x
• Agarosa 100g
• Microondas
• Pipeta y prepipeta
• Matraz Erlenmeyer
• Probeta
• Agua destilada
• Colorante Midori Green
• Agua para biología molecular

PROCEDIMIENTO: TAMPÓN ELECTROFORESIS

1. Añadimos a una probeta de 300 mL un poco de agua destilada y después los 30 mL de TBE10x 
2. Añadimos agua destilada hasta 300 mL 
3. Mezclamos

PROCEDIMIENTO: AGAROSA

1. Preparamos la bandeja con el peine 
2. Pesamos la agarosa (1g) directamente en el matraz erlenmeyer y añadimos los 50 mL de TBE
3. Lo introducimos en el microondas y vamos comprobando y agitando el vaso de vez en cuando hasta que se vuelva transparente 
4. Añadimos 5 µl de Midori Green a la agarosa líquida, movemos para distribuir uniformemente 
5. Lo vertimos cuidadosamente en la bandeja con el peine colocado para evitar la formación de burbujas
6. Dejamos que polimerice a temperatura ambiente hasta que la agarosa deje de estar transparente
7. Quitamos el peine levantándolo cuidadosamente y evitando moverlo hacia los lados para no mover los pocillos

OBSERVACIONES

También se realizó un gel de electroforesis grande con un mayor número de peines para que en la próxima practica toda la clase practicara sobre el mismo gel.

Cargar el Gel de Electroforesis

OBJETIVO

Simulación para aprender a cargar el gel de electroforesis.

MATERIAL

• Gel de silicona
• Pipeta y pintas de pipeta
• Cubeta con agua 
• Microtubo con agua y colorante

PROCEDIMIENTO

1. Una vez que tenemos la cubeta con agua suficiente como para sumergir el gel, lo introducimos y lo dejamos pegado al fondo
2. Introducimos la pipeta de 5 µl con cuidado y cargamos el gel
3. Después lo sacamos y lo secamos cuidadosamente

OBSERVACIONES

Es importante no introducir demasiado la pinta en el gel o podríamos bloquear el pipeteo o por el contrario no adentrarnos lo suficiente en el gel.

Continuamos con la Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIAL

• Nuestro tubo cónico con la preparación
• NaCl saturado 
• Etanol absoluto 
• Etanol 70% 
• 2 microtubos
• Varilla 
• Agua estéril destilada
• Gradilla

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 160  μL de NaCl y lo llevamos al vortex
2. Añadimos dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclamos por inmersión observando la formación de un ovillo de ADN precipitado
3. 
   
4. Capturamos la madeja de ADN  con una varilla 
5. Lavamos la madeja con un microtubo con etanol al 70% 
6. Dejamos secar el ADN  en la varilla durante 30 minuto, apoyando la varilla sobre una gradilla y la pasamos a un microtubo vacío 
7. La resuspendemos en 300  μL de agua estéril destilada 

OBSERVACIONES

En nuestra primera preparación no obtuvimos el ADN de la sangre, esta era muy oscura pero realmente no sabemos cual fue el problema en concreto, en vista de que el color de nuestra sangre y los resultados que obteníamos tras los pasos, decidimos que a parte de acabar hoy la práctica con esa muestra iniciaríamos otra vez la práctica con otra muestra distinta de sangre.

Así que la segunda muestra se quedó en incubación a temperatura ambiente durante la noche y al día siguiente pudimos capturar su ADN.

Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIALES

• Muestra de sangre
• Tampón de lisis (Tris-HCl 10mM, MgCl2 5mM, Sacarosa 0.32M, Tritón-X100 1%)
• NaCl 0.9%
• SDS 20%
• Proteinasa K
• Tubo cónico
• Agua biología molecular

PROCEDIMIENTO

1. Lo primero que vamos ha hacer es preparar el NaCl de 4M, 3.5g , añadimos agua de biología molecular hasta 10mL y disolvemos con un agitador magnético, lo dejamos a temperatura ambiente hasta su uso
   
2. Partimos de 2 mL de sangre periférica en EDTA 
3. Añadimos 10 mL de tampón de lisis y mezclamos por inversión 
4. Dejamos en la nevera 30 min 
5. Centrifugación 15 min a 2500 rpm, retiramos sobrenadante por decantación
6. Añadimos NaCl 0.9% hasta 4 mL y disolvemos el pellet
7. Centrifugar 15 min po a 2500 rpm 
8. Eliminar sobrenadante por decantación
9. Añadir 160 μL de taampón de lisis, 25 μL de SDS 20% y 2.5 μL de Proteinasa K y agitamos con vortex
10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche 

OBSERVACIONES

Con el fin de obtener un mejor resultado se dejaron 35 minutos en vez de 30 el tubo con la sangre y el tampón de Lisis.