Preparación del Gel de Agarosa y Tampón de Electroforesis

OBJETIVO

Preparar los reactivos (gel de agarosa y tampón de electroforesis) para poder llevar a cabo una electroforesis.

MATERIALES

• Bandeja con peine
• Agarosa
• TBE 10x
• TBE 1x
• Agarosa 100g
• Microondas
• Pipeta y prepipeta
• Matraz Erlenmeyer
• Probeta
• Agua destilada
• Colorante Midori Green
• Agua para biología molecular

PROCEDIMIENTO: TAMPÓN ELECTROFORESIS

1. Añadimos a una probeta de 300 mL un poco de agua destilada y después los 30 mL de TBE10x 
2. Añadimos agua destilada hasta 300 mL 
3. Mezclamos

PROCEDIMIENTO: AGAROSA

1. Preparamos la bandeja con el peine 
2. Pesamos la agarosa (1g) directamente en el matraz erlenmeyer y añadimos los 50 mL de TBE
3. Lo introducimos en el microondas y vamos comprobando y agitando el vaso de vez en cuando hasta que se vuelva transparente 
4. Añadimos 5 µl de Midori Green a la agarosa líquida, movemos para distribuir uniformemente 
5. Lo vertimos cuidadosamente en la bandeja con el peine colocado para evitar la formación de burbujas
6. Dejamos que polimerice a temperatura ambiente hasta que la agarosa deje de estar transparente
7. Quitamos el peine levantándolo cuidadosamente y evitando moverlo hacia los lados para no mover los pocillos

OBSERVACIONES

También se realizó un gel de electroforesis grande con un mayor número de peines para que en la próxima practica toda la clase practicara sobre el mismo gel.

Cargar el Gel de Electroforesis

OBJETIVO

Simulación para aprender a cargar el gel de electroforesis.

MATERIAL

• Gel de silicona
• Pipeta y pintas de pipeta
• Cubeta con agua 
• Microtubo con agua y colorante

PROCEDIMIENTO

1. Una vez que tenemos la cubeta con agua suficiente como para sumergir el gel, lo introducimos y lo dejamos pegado al fondo
2. Introducimos la pipeta de 5 µl con cuidado y cargamos el gel
3. Después lo sacamos y lo secamos cuidadosamente

OBSERVACIONES

Es importante no introducir demasiado la pinta en el gel o podríamos bloquear el pipeteo o por el contrario no adentrarnos lo suficiente en el gel.

Continuamos con la Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIAL

• Nuestro tubo cónico con la preparación
• NaCl saturado 
• Etanol absoluto 
• Etanol 70% 
• 2 microtubos
• Varilla 
• Agua estéril destilada
• Gradilla

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 160  μL de NaCl y lo llevamos al vortex
2. Añadimos dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclamos por inmersión observando la formación de un ovillo de ADN precipitado
3. 
   
4. Capturamos la madeja de ADN  con una varilla 
5. Lavamos la madeja con un microtubo con etanol al 70% 
6. Dejamos secar el ADN  en la varilla durante 30 minuto, apoyando la varilla sobre una gradilla y la pasamos a un microtubo vacío 
7. La resuspendemos en 300  μL de agua estéril destilada 

OBSERVACIONES

En nuestra primera preparación no obtuvimos el ADN de la sangre, esta era muy oscura pero realmente no sabemos cual fue el problema en concreto, en vista de que el color de nuestra sangre y los resultados que obteníamos tras los pasos, decidimos que a parte de acabar hoy la práctica con esa muestra iniciaríamos otra vez la práctica con otra muestra distinta de sangre.

Así que la segunda muestra se quedó en incubación a temperatura ambiente durante la noche y al día siguiente pudimos capturar su ADN.

Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIALES

• Muestra de sangre
• Tampón de lisis (Tris-HCl 10mM, MgCl2 5mM, Sacarosa 0.32M, Tritón-X100 1%)
• NaCl 0.9%
• SDS 20%
• Proteinasa K
• Tubo cónico
• Agua biología molecular

PROCEDIMIENTO

1. Lo primero que vamos ha hacer es preparar el NaCl de 4M, 3.5g , añadimos agua de biología molecular hasta 10mL y disolvemos con un agitador magnético, lo dejamos a temperatura ambiente hasta su uso
   
2. Partimos de 2 mL de sangre periférica en EDTA 
3. Añadimos 10 mL de tampón de lisis y mezclamos por inversión 
4. Dejamos en la nevera 30 min 
5. Centrifugación 15 min a 2500 rpm, retiramos sobrenadante por decantación
6. Añadimos NaCl 0.9% hasta 4 mL y disolvemos el pellet
7. Centrifugar 15 min po a 2500 rpm 
8. Eliminar sobrenadante por decantación
9. Añadir 160 μL de taampón de lisis, 25 μL de SDS 20% y 2.5 μL de Proteinasa K y agitamos con vortex
10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche 

OBSERVACIONES

Con el fin de obtener un mejor resultado se dejaron 35 minutos en vez de 30 el tubo con la sangre y el tampón de Lisis.

Observación de Cromosomas en Metafase

OBJETIVO

Después de teñir nuestra preparación pasamos a observar los cromosomas.

MATERIALES

• Microscopio
• Preparación 
• Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Limpiamos los objetivos
2. Enfocamos y ponemos las condiciones de diafragma abierto y luz cerrada
3. Colocar el aceite de inmersión, ya no se usa el tornillo macrométrico, solo el micrométrico para ajustar la imagen
4. Como la distancia en estos aumentos es mínima entre la preparación y el objetivo, tenemos que tener mucho cuidado de no romperla
5. Al terminar se limpia todo bien para que no quede aceite de inmersión

OBSERVACIONES

En nuestras preparaciones no observamos cromosomas en metafase.

Bandeo y Tinción de los Cromosomas

Una vez que hemos cultivado nuestras células, las hemos sometido a el proceso de el sacrificio y a una fijación, llega el momento de preparar la muestra para que sea observada, este será el objetivo de hoy.
Puesto que el Viernes no dio tiempo a hacer ningún lavado con fijador y guardemos nuestro tubo en el frigorífico con el carnoy, lo sacaremos y hoy continuaremos con los lavados que nos faltaron.

MATERIAL:

• Centrífuga
• Carnoy
• Tripsina
• Pipetas y prepipetas
• Pipetas pasteur
• Matraces
• Tinción giemsa
• Portaobjetos
• Funda para el portaobjetos
• Vasos de precipitado
• Solución tampón

PROCESO:

1. Centrifugamos nuestro tubo durante 5 min a 1000rpm.
2. Retiramos el sobrenadante.
3. Añadimos 1mL de carnoy, resuspendemos, y añadimos otros 4mL de carnoy, volvemos a resuspender.
4. El proceso de el punto 1 al 3 lo repetimos en cuatro ocasiones.
5. Una vez que hemos terminado los lavados, centrifugamos el tubo y retiramos sobrenadante, dejando 0.5mL, resuspendemos bien.
6. Mojamos el portaobjetos, limpio y correctamente, con agua fría.
7. Dejamos caer sobre el porta objetos 4 o 5 gotas con una pipeta pasteur  de la suspensión de núcleos a una distancia de 5-10 cm de altura en el centro de el porta y se deja resbalar la gota inclinando el porta para que extienda por toda la superficie 
8. Esperamos a que se seque. 
9. Mis compañeros prepararon la solución de bandeo, para ello la tripsina venia en una pastilla, la pastilla se disolvió en un litro de agua, aunque se disolvió en algo menos de el litro y luego se añadió el litro completo. De ahí se cogieron 40mL y se mezclaron con 40mL de buffer.
10. Sobre el papel de trabajo preparamos un vaso de precipitado con la tripsina, otro vaso de precipitado con solución tampón pH 6.8, un vaso con la tinción giemsa y otro con agua fría.
11. Se introduce en el vaso de tripsina el portaobjetos y inmediatamente después se introduce en el vaso de la solución tampón, luego en el vaso de la tinción giemsa durante dos min y después lo introducimos en agua fría.
12. Dejamos secar el porta objetos.

OBSERVACIONES:

En nuestro grupo pudimos hacer tres portaobjetos.

Sacrificio

Continuamos con el cariotipo en sangre periférica.
El objetivo de hoy es añadir la colchicina para poder para detener las células en mitosis, llevar a cabo el choque hipotónico para hinchar las células y se visualicen mejor los cromosomas más su consecuente fijación, el objetivo en principio fue después de fijar efectuar los lavados con el fijador y hacer las extensiones en el porta.

MATERIALES:

• Colchicina
• Estufa
• Centrífuga
• Tubos de centrífuga
• Pipetas pasteur
• 5mL de Cloruro Potásico
• Pipetas, prepipetas
• Fijador
• Cabina de flujo laminar
• Cubetas para desechos

PROCEDIMIENTO:

1. Sacamos nuestro tubo para el cariotipo de la incubadora y le añadimos 0.25 mL de colchicina, agitamos suavemente y dejamos en el incubador 45' a 37ºC.
2. Una vez pasados los 45 min, centrifugamos el tubo durante 5min a 1000rpm.
3. Con el tubo centrifugado eliminamos el sobrenadante con una pipeta pasteur, el sobrenadante lo iremos depositando en un bote de residuos.
4. Ahora procedemos al choque hipotónico, añadimos 1mL de Cloruro Potásico, mientras lo añadimos vamos mezclando a la vez
5. Resuspendemos para deshacer el tampón de pipeteo.
6. Luego añadimos otros 4mL en el tubo, y como antes mientras lo añadimos resuspendemos.
7. Centrifugamos durante 5' a 1000rpm, después eliminamos el sobrenadante.
8. Añadimos con una pipeta pasteur 1mL de fijador, se resuspende bien y despacio.
9. Ahora añadimos otros 4mL de fijador y resuspendemos.

OBSERVACIONES:

El protocolo seguiría con otra centrifugación y con la repetición de los pasos 8 y 9 con una centrifugación dos o tre veces hasta que se nos quede el tubo prácticamente transparente.

Además incluye las extensiones en el porta.

Por motivos de horarios de clase, no nos ha dado tiempo a incluir estos pasos hoy, así que hemos detenido el proceso en la fijación y hemos almacenado los tubos en un frigorífico.