Observación de Cromosomas en Metafase

OBJETIVO

Después de teñir nuestra preparación pasamos a observar los cromosomas.

MATERIALES

• Microscopio
• Preparación 
• Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Limpiamos los objetivos
2. Enfocamos y ponemos las condiciones de diafragma abierto y luz cerrada
3. Colocar el aceite de inmersión, ya no se usa el tornillo macrométrico, solo el micrométrico para ajustar la imagen
4. Como la distancia en estos aumentos es mínima entre la preparación y el objetivo, tenemos que tener mucho cuidado de no romperla
5. Al terminar se limpia todo bien para que no quede aceite de inmersión

OBSERVACIONES

En nuestras preparaciones no observamos cromosomas en metafase.

Bandeo y Tinción de los Cromosomas

Una vez que hemos cultivado nuestras células, las hemos sometido a el proceso de el sacrificio y a una fijación, llega el momento de preparar la muestra para que sea observada, este será el objetivo de hoy.
Puesto que el Viernes no dio tiempo a hacer ningún lavado con fijador y guardemos nuestro tubo en el frigorífico con el carnoy, lo sacaremos y hoy continuaremos con los lavados que nos faltaron.

MATERIAL:

• Centrífuga
• Carnoy
• Tripsina
• Pipetas y prepipetas
• Pipetas pasteur
• Matraces
• Tinción giemsa
• Portaobjetos
• Funda para el portaobjetos
• Vasos de precipitado
• Solución tampón

PROCESO:

1. Centrifugamos nuestro tubo durante 5 min a 1000rpm.
2. Retiramos el sobrenadante.
3. Añadimos 1mL de carnoy, resuspendemos, y añadimos otros 4mL de carnoy, volvemos a resuspender.
4. El proceso de el punto 1 al 3 lo repetimos en cuatro ocasiones.
5. Una vez que hemos terminado los lavados, centrifugamos el tubo y retiramos sobrenadante, dejando 0.5mL, resuspendemos bien.
6. Mojamos el portaobjetos, limpio y correctamente, con agua fría.
7. Dejamos caer sobre el porta objetos 4 o 5 gotas con una pipeta pasteur  de la suspensión de núcleos a una distancia de 5-10 cm de altura en el centro de el porta y se deja resbalar la gota inclinando el porta para que extienda por toda la superficie 
8. Esperamos a que se seque. 
9. Mis compañeros prepararon la solución de bandeo, para ello la tripsina venia en una pastilla, la pastilla se disolvió en un litro de agua, aunque se disolvió en algo menos de el litro y luego se añadió el litro completo. De ahí se cogieron 40mL y se mezclaron con 40mL de buffer.
10. Sobre el papel de trabajo preparamos un vaso de precipitado con la tripsina, otro vaso de precipitado con solución tampón pH 6.8, un vaso con la tinción giemsa y otro con agua fría.
11. Se introduce en el vaso de tripsina el portaobjetos y inmediatamente después se introduce en el vaso de la solución tampón, luego en el vaso de la tinción giemsa durante dos min y después lo introducimos en agua fría.
12. Dejamos secar el porta objetos.

OBSERVACIONES:

En nuestro grupo pudimos hacer tres portaobjetos.

Sacrificio

Continuamos con el cariotipo en sangre periférica.
El objetivo de hoy es añadir la colchicina para poder para detener las células en mitosis, llevar a cabo el choque hipotónico para hinchar las células y se visualicen mejor los cromosomas más su consecuente fijación, el objetivo en principio fue después de fijar efectuar los lavados con el fijador y hacer las extensiones en el porta.

MATERIALES:

• Colchicina
• Estufa
• Centrífuga
• Tubos de centrífuga
• Pipetas pasteur
• 5mL de Cloruro Potásico
• Pipetas, prepipetas
• Fijador
• Cabina de flujo laminar
• Cubetas para desechos

PROCEDIMIENTO:

1. Sacamos nuestro tubo para el cariotipo de la incubadora y le añadimos 0.25 mL de colchicina, agitamos suavemente y dejamos en el incubador 45' a 37ºC.
2. Una vez pasados los 45 min, centrifugamos el tubo durante 5min a 1000rpm.
3. Con el tubo centrifugado eliminamos el sobrenadante con una pipeta pasteur, el sobrenadante lo iremos depositando en un bote de residuos.
4. Ahora procedemos al choque hipotónico, añadimos 1mL de Cloruro Potásico, mientras lo añadimos vamos mezclando a la vez
5. Resuspendemos para deshacer el tampón de pipeteo.
6. Luego añadimos otros 4mL en el tubo, y como antes mientras lo añadimos resuspendemos.
7. Centrifugamos durante 5' a 1000rpm, después eliminamos el sobrenadante.
8. Añadimos con una pipeta pasteur 1mL de fijador, se resuspende bien y despacio.
9. Ahora añadimos otros 4mL de fijador y resuspendemos.

OBSERVACIONES:

El protocolo seguiría con otra centrifugación y con la repetición de los pasos 8 y 9 con una centrifugación dos o tre veces hasta que se nos quede el tubo prácticamente transparente.

Además incluye las extensiones en el porta.

Por motivos de horarios de clase, no nos ha dado tiempo a incluir estos pasos hoy, así que hemos detenido el proceso en la fijación y hemos almacenado los tubos en un frigorífico.

Inicio en el Cariotipo en Sangre Periférica

El objetivo de esta practica es preparar la muestra de sangre para posteriormente poder elaborar un cariotipo.

MATERIALES:

• Gradilla
• Toallitas desinfectantes
• Lancetas
• Capilares
• Baño termoestático
• Medio de cultivo
• Pipeta de 0.25ml y sus puntas
• Fitohemaglutinina 
• Incubador de CO2
• 0.4ml de sangre

PROCEDIMIENTO:

1. El medio de cultivo (7ml), que hemos identificado, se encuentra congelado por lo que lo introducimos en el baño termoestático a 30º, también introduciremos un tubo de fitohemaglutinina que usaremos toda lal clase de el cual cada grupo extraemos 0.25ml, los necesarios para para preparar nuestra muestra.
2. Después de la descongelación homogeneizamos tanto el medio de cultivo como la fitohemaglutinina.
3. Extraemos la sangre, realizamos dos punciones con la lanceta en los dos dedos corazón. La sangre que va saliendo la introducimos en 4 capilares que en total sumarán 0.4ml de sangre.
4. Añadimos los 0.25 de fitohemaglutinina a el medio de cultivo, antes de añadir la sangre.
5. A continuación agitamos la sangre y le añadimos 0.4ml de sangre a el medio de cultivo.
6. Volvemos a agitar nuestro tubo y lo introducimos en el incubador de CO2 a 37º por 72h y ligeramente abierto.

OBSERVACIONES:

En nuestro cultivo hubo un error en el procedimiento, no se añadió primero la fitohemaglutinina, una lectina que induce la mitosis y la proliferación celular, si no que se introducieron 0.2ml de sangre, la fitohemaglutinina y los 0.2ml de sangre restantes.

Por otro lado también hay que mencionar que la incubación requiere de un periodo de 72 horas, pero por motivos de horarios de clase nuestras células serán incubadas durante 92 horas.

Criopreservación Hibridomas

En la práctica anterior calculemos cual era la viabilidad de nuestro cultivo y el número de crioviales que nos hacían falta para congelar nuestro cultivo de hibridomas.

El objetivo de la práctica no es otro que la criopresevación de hibridomas.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Control de Cultivo de Hibridomas

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando la evolución de nuestro cultivo de hibridomas.

Realizamos exactamente el mismo procedimiento de el día anterior, aunque esta vez no se le renueva el medio a las células, este conteo que realizaremos hoy nos servirá para la congelación que realizaremos este Viernes.

Tinción de Azul Tripán en Hibridomas

El objetivo de esta práctica es hacer un control sobre la situación en la que se encuentra nuestro cultivo de células hídridas.
Para ello realizaremos una tinción de azul tripán como para las células de insecto.

MATERIALES:

•  Nuestro T25
• Azul Tripán
• Cámara de recuento celular 
• Microscopio
• Tubo ependorff.
• Micropipeta

PROCEDIMIENTO:

1. Cogemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán.

7. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

8.Las observamos a el microscopio y realizamos el conteo.

9.Por otro lado retiramos el sobrenadante de nuestro cultivo y añadimos medio fresco, de la misma manera que lo hicimos con nuestro cultivo de células de insecto, y de igual forma lo introducimos de nuevo en la centrífuga.

Cultivo de Hibridomas

Los hibridomas son líneas celulares resultantes de la fusión de dos tipos celulares: un linfocito B y una línea celular derivada de un tumor de linfocitos B, se obtiene como resultado una mezcla heterogénea de células híbridas, seleccionándose a partir de ellas aquellas células con la capacidad de producir el anticuerpo deseado y de proliferar indefinidamente.
El objetivo de esta práctica es iniciarnos en el cultivo de los hidridomas.

MATERIAL:

• Kitasato y goma de vacio
• PBS (Suero Fetal Bovino), que será nuestro medio de cultivo
• Hibridomas en suspensión
• Pipetas y prepipetas 
• T25
• Incubador
• Gradillas
• Rotulador permanente

PROCEDIMIENTO:

1. Filtramos el medio de cultivo (PBS) en un ambientes estéril a través de un kitasato, dentro de la cabina, con un filtro de 20 micras.
2. Alicuotamos 8 ml de medio de cultivo, que es el que tendrá cada grupo de prácticas.
3. De los 8 ml de medio introducimos 4ml en un T25 y lo identificamos correctamente.
4. A continuación introducimos 1 ml de células en suspensión.
5. Cerramos nuestro T25 lo sacamos de la cabina y lo introducimos en el incubador, una vez dentro abrimos el T25 parcialmente.

Criopreservación Células de Insecto

Antes de proceder a congelar nuestras células tenemos que realizar una tinción de azul tripán, como anteriormente, para calcular la viabilidad de nuestras células y el numero de crioviales  que necesitaremos para congelarlas, pero en la práctica de hoy nos centraremos en la criopreservación como tal.

El objetivo de esta práctica es aprender a mantener nuestras células a través de la criopreservación.

MATERIALES:

• Nuestro T25
• Pipetas
• Prepipetas
• DMSO o glicerol
• Centrífuga
• PBS
• Tubo falcon 
• Crioviales

CONGELACIÓN:

1.Sacamos nuestro T25 de la incubadora, siempre cerrándolo antes de sacarlo.

2.De manera aséptica, en nuestra cabina, lo pasamos a un tubo Falcon.

3.Centrifugamos durante 8 min.

4.Volvemos a la cabina con el falcon centrifugado y quitamos el sobrenadante.

5.Debido a la viabilidad de las células añadimos el DMSO+PBS necesario.

6.Resuspendemos en el tubo falcon.

7.Dividimos la mezcla en los crioviales. 

8.Finalmente metemos en el congelador a -80ºC

Continuamos el Control de el Cultivo

Objetivo de la práctica de hoy es seguir observando como evoluciona nuestro cultivo, de la misma forma que hemos ido haciendo días atrás.

Control de el Cultivo y Cambio de Medio

En esta práctica realizamos un cambio de medio para retirar las sustancias de desecho de las células y para añadir a nuestro T25 medio fresco, a la vez que observamos el cultivo.

MATERIAL:

• Tubo para cultivo T25
• Pipetas.
• Microscopio invertido.
• Tubo falcon.

PROCEDIMIENTO:

1.Observamos en el microscopio invertido la situación en la que se encuentra nuestro cultivo.

2.Pasamos los 5 ml de medio a un tubo de centrífuga y lo centrifugamos durante 8 min.

3.Después retiramos sobrenadante y añadimos medio fresco hasta llegar a 5 ml.
4.Lo pasamos a el T25 y lo metemos en el incubador, una vez dentro lo abrimos parcialmente.

Recuento de Células

El objetivo de la practica de hoy es entender como se procede a contar células en una cámara de neubauer para poder aplicarlo posteriormente en nuestras prácticas de cultivos celulares.

MATERIALES:

•  Frasco celular T25. 
• Azul Tripán. 
• Cámara de recuento celular. 
• Microscopio.
• Tubo ependorff.
• Micropipeta de 10µl

PROCEDIMIENTO:

1. Cojemos el frasco de cultivo de la cámara de incubación.

2. Pipeteamos arriba y abajo 3 veces y dispersamos las células para obtener una suspensión de células individuales. 

3. Transferir 20 µl de suspensión dentro de un tubo ependorff. 

4. Añadir 20 µl de azul Tripán. El azul es un colorante que mancha las células muertas y no las células vivas. 

5. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo tocando el fondo del tubo.

6. Transferir 10 µl de células manchadas de azul Tripán a un laterar de la cámara de neubauer.

7.Un aspecto muy a tener en cuenta a la hora de observar las células para el contaje no puede ser otro que el manejo de el microscopio para poder visualizarlas lo mejor posible, a la hora de visionar las células tenemos que tener en cuenta:

• El microscopio a de estar al 10x10, es decir 10 en ocular y al 10 de objetivo
• El diafragma medio cerrado
• El condensador bajado, no debe emitir mucha luz sobre nuestra muestra, ya que el calor de esta podría afectarle
  

La imagen representa más o menos que nos encontraremos al observar nuestra cámara de neubauer y las flechas la dirección al contar las células, esta imagen muestra un cuadro de los cuatro que podemos contar en la cámara. 
9.Una vez contados nuestros cuadros pasaríamos a calcular la concentración de células/ml.

Técnica Aséptica

Pronto empezaremos a trabajar el cultivo de células y para ello es imprescindible trabajar preservando la asepsia, todos los materiales y superficies que entren en contacto con el cultivo deben permanecer estériles.

PARA REALIZAR LA TÉCNICA ASÉPTICA:

1. Pulverizamos la superficie en la que vamos a trabajar con etanol al 70%. 
2. Cogemos los componentes del medio de cultivo de la nevera o congelador, los botes de muestra o tubos con etanol al 70%, solo cogemos lo que necesitamos. 
4. Ordenamos la zona de trabajo para no tener que levantarse, evitamos que hayan muchas cosas en la mesa por que aumenta el riesgo de contaminación de la pipeta. 
5. Limpiamos cualquier vertido con etanol al 70% para minimizar la contaminación del medio de cultivo. 
6. Para terminar, eliminamos los restos de las soluciones manteniendo sólo las botellas que sean necesarias. 

Higiene personal:

1. Nos recogemos el pelo y hablamos lo mínimo. 
2. Rociamos los guantes desechables con etanol al 70%. 

Pipeteado y uso de reactivos:

1. Usamos dispensador de plástico estériles (puntas desechables) de 10 y 25 ml. 
2. No dejamos el bote en vertical pero tampoco en un ángulo que permita el derrame del contenido.
3. No dejamos el reactivo abierto y no trabajamos sobre el bote abierto. 
4. El frasco de cultivo debería estar fijado horizontalmente cuando está abierto y mantener el ángulo durante su manipulación. 
Al finalizar la práctica retiramos todas las pipetas, frascos, etc. utilizadas y no utilizadas de la mesa de trabajo y limpiamos con etanol al 70% toda la superficie, guardamos todos los reactivos a la nevera o congelador. 

Alicuotar el Medio

A través de esta practica comenzamos nuestro cultivo celular de células de insecto, y por lo tanto a adquirir conocimientos ya aplicados sobre como hacerlo.

LOS MATERIALES:

• Recipiente para desechos en la cabina
• Etanol 70% en botellas de aerosol. 
• Pipeta automática y pipetas con perilla.
• Rotulador permanente.
• Guantes desechables de laboratorio. 
• Tubos de fondo cónico de 50 ml (estériles).
• Frasco cultivo celular (estéril, 25 cm2 ) (T-25).
• Medio de cultivo de células de insecto. 
• Medio fresco 

PROCEDIMIENTO:

Para comenzar limpiamos, como ya hemos echo en una anterior práctica, adecuadamente nuestra cabina de flujo laminar.
Una vez preparada la cabina y los materiales dentro de ella nos turnamos y vamos realizando de forma aséptica el repartir 20 ml de medio de células del insecto en 6 tubos de 50 ml. Cada grupo tendrá su tubo.

Tomamos de el tubo falcon 4 ml (medio de cultivo) y se lo añadimos a un frasco T25 esteril, después le añadimos 1 ml de células de insecto en suspensión , lo cerramos y lo rotulamos por el lateral indicando que son células de insecto y el grupo al que pertenecen.
Comprobamos que el T25 esté cerrado antes de sacarlo de la cabina y lo introducimos en un incubador, una vez dentro dejamos el tapón medio abierto y cerramos el incubador.

Después de la práctica dejamos ordenado y limpio el laboratorio.

¿Sal, Detergente, Alcohol?

La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más facilmente del ADN.

El detergente (O gel o champú) utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo que estamos utilizando; el detergente disuelve las grasas, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior. 

El ADN es una molécula muy larga y tiende agruparse. De ahí la facilidad para retirarla. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Gracias a las propiedades de estas sustancias tan comunes que podemos encontrar por casa es posible hacer una extracción de ADN casera.

Extracción Casera de ADN de la Mucosa Bucal

La técnica que vamos a poner en práctica hoy nos recordará mucho a la anterior de 
laboratorioclinicoybiomediconuria.blogspot.com.es/2016/10/extraccion-casera-de-adn-vegetal.html
Esto se debe a que ambos se rigen por el mismo fundamento el cual explicaré en la siguiente entrada de el blog.
De momento nos centraremos en cómo hemos extraido de forma casera el ADN de nuestra mucosa bucal.
El ADN procede de las células de descamación del epitelio mucoso del interior de la boca. 

MATERIAL 

• Agua destilada o mineral 
• Alcohol de 96º muy frío 
• Un asa de siembra 
• Sal común 
• Detergente lavavajillas 
• Vasos desechables 
• Tubo de ensayo 
• Gradilla 
• Tubos eppendorf 
• Alcohol de 70º Procedimiento. 
• Azul de metileno

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos un tubo de ensayo con alcohol etílico de 96 º
2. Ponemos un poco de agua en un vaso y nos enjuagamos la boca enérgicamente durante al menos medio minuto para arrastrar el mayor número posible de células de descamación de la mucosa bucal, antes de hacerlo tragamos saliva para eliminar la acción de los enzimas contenidos en ella.
3. Colocamos unos 20 ml de agua destilada con dos pizcas de sal, en otro vaso y un par de gotas de detergente lavavajillas. 
4. Expulsamos el agua en el vaso de precipitados sobre la solución anterior y dejamos actuar durante unos 10 minutos, removiendo de vez en cuando suavemente para disolver estos componentes evitando la formación de espuma. 
5. A continuación, añadimos la solución suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol muy frío dejándola resbalar por la pared del tubo inclinado. 
6. La dejamos reposar durante 2 ó 3 min
   utos sin moverlo en absoluto. 
7. Tras estos minutos de reposo, el ADN sube hacia la superficie de el alcohol.
8. Entonces lo recogemos con un asa de siembra enrrollando la ''gelatina'' que forma el ADNsuavemente. 
9. Finalmente suspendemos el ADN extraído en un eppendorf con Alcohol de 70º
10. Y en nuestro caso ponemos una gotita de azul de metileno en el ependorff para visualizarlo.

Extracción Casera de ADN Vegetal

Con este método casero se puede extraer el ADN de diversos tipos de frutas y verduras, en nuestro caso el de un plátano.
      Necesitaremos

• 50g de plátano
• Batidora de mano
• Matraz
• Filtro tipo cafetera
• Embudo para filtrar
• Alcohol 96º muy frío
• Pipeta Pasteur
• Tubo de ensayo
• Gradilla
• Vaso para batir
• Agua destilada
• Espátula
• Vaso de precipitados
• Detergente tipo lavavajillas
• Un poco de sal común

    Procedimiento

1.  Batimos el plátano en 250 ml de agua destilada o en su defecto mineral, nunca de el grifo, durante 15 a 20 segundos hasta obtener una papilla homogénea. 
2. Preparamos un tubo de ensayo por cada extracción con alcohol etílico y poner a enfriar en la nevera.
3. Por otra parte, en un vaso de precipitado pequeño se mezclamos una cucharada de champú o lavavajillas líquido con dos pizcas de sal de mesa y 20 ml de Agua destilada. 
4. Añadimos tres cucharadas del puré de plátano a la mezcla de lavavajillas, sal y agua. 
5. Removemos durante 5-10 minutos, con cuidado de no formar mucha espuma.
6. Para eliminar los restos tisulares y celulares, dejamos filtrar la solución durante varios minutos en papel de filtro, filtro de cafetera o un paño de algodón suave, hasta obtener aproximadamente 5 ml de filtrado. 
7. Tomamos el filtrado y añadimos en el tubo de ensayo que contiene el alcohol frio, resbalando por las paredes. Dejar reposar durante 2 ó 3 minutos sin moverlo en absoluto.
8. Después extraemos la especie de ''gelatina'' que se nos debe de haber formado en el tubo de ensayo, y lo introducimos en un tubo enpendorff, que tenemos preparado con alcohol 70º frío, con una varilla. Para visualizar el ADN lo teñimos con una gotita de Azul de metileno.
   

La Cabina de Flujo Laminar

La cabina de flujo laminar es un equipo con el que trabajaremos muy a menudo en el laboratorio de biología molecular. 

En esta práctica aprendemos a trabajar con la cabina de flujo laminar y a realizar una limpieza correcta de la misma. 

Procedimientos generales de desinfección y limpieza de la CFL 

1. La limpieza y desinfección se realizará: antes de comenzar cualquier trabajo en la cabina, al finalizar el trabajo, siempre que cambie el programa de trabajo y cuando se produzcan derrames 

2. Limpiar la cabina con alcohol a el 70%, agua jabonosa y de nuevo desinfectar con alcohol a el 70% 

3. La limpieza se realizará con guantes de un solo uso, bata y gasas estériles 

4. Mucho cuidado de no mojar el filtro HEPA de la cabina 

5. Todos los materiales usados para la limpieza se consideran residuos contaminados 

Algunas normas de trabajo en la CFL son 

• Cerrar la puerta de el recinto para evitar las corrientes de aire y mantener la asepsia  
• La cabina se conectaré unos 15 min antes de empezar a trabajar 
• Todo el material que se introduzca en la cabina tiene que ser estéril y/o pulverizado con alcohol de 70% 
• Dentro de la cabina dispondremos los materiales que vayamos a usar de manera que no estén cerca de el borde ni de la rejilla de el filtro, normalmente se sitúan a la izquierda y a la derecha pondremos algún recipiente para desechos.  
• Minimizar los movimientos dentro y fuera de la cabina 
• No trabajar con los codos apoyados en la superficie de la cabina, esto cortaría la corriente de el flujo laminar 

• 

  
  

  Evitar la proyección de líquidos sobre el filtro HEPA