Realización Electroforesis (Rh)

OBJETIVO

Seguimos con la practica para la determinación del Rh, ya tenemos preparadas las muestras directas para realizar la elecreoforesis.

MATERIALES

• Muestras de ADN
• Marcador de peso molecular
• Geles de Silver green y Dana green 
• Cubeta de electroforesis
• Controles negativo y positivo 
• TAE

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta colocando dos geles uno de Dana green y otro de Silver Green, con cuidado de que no se toquen, llenamos de TAE (tampón de electroforesis) la cubeta intentando que no se nos despeguen los geles
2. Procedemedos a cargar los geles, anotando siempre que estamos cargando y donde
3. Conectamos a la corriente los electrodos programamos el voltaje y tiempo de electroforesis

OBSERVACIONES

Al observar los resultados entendemos que o bien el tiempo de la electroforesis tenía que haber sido más largo o que el gel hubiese tenido una menos concentración, dado que la muestra a podido correr muy poco por el gel.

Determinación del Factor Rh por PCR

OBJETIVOS

Continuar aprendiendo sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el de la determinación del Rh, el factor Rh es una proteína integral de la membrana de los glóbulos rojos, positivos son aquellas personas que presentan dicha proteína en sus eritrocitos y negativa quienes no presenten la proteína. Esto es lo que vamos a determinar con esta prueba.Hoy prepararemos los geles donde posteriormente se hará la determinación y prepararemos las muestras y controles para llevar acabo la PCR.

Explicaré el crocedimiento de el gel de Dana Green, ya que el de Silver Green está en post anteriores.

MATERIAL

• Tubos de 0.2 mL
• Agarosa
• TBE 1x
• Mix PCR
• Agua de biología molecular
• ADN
• Control positivo
• Matraz Erlenmeyer
• DanaBlue 
• Agarosa

PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DEL GEL CON DANA GREEN:

1. En un matraz Erlenmeyer de 100mL, añadimos 32 mL de tampón de electroforesis 1x más 0.60 gr de agarosa (2%)
2. Añadimos 80 μL de DanaBlue 0.1%, agitamos para disolver los grumos de agarosa.
3. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa llevándola a ebullición. La solución resultante tiene que aparecer clara, sin partículas aparentes.
4. Enfriamos la solución más o menos hasta 55%. 
5. Ponemos el peine en el molde y añadimos la mezcla cuidadosamente hasta que se enfríe del todo.
6. Lo sacamos del molde y lo guardamos hasta que los usemos para realizar la electroforesis.

PREPARACIÓN DEL LAS MUESTRAS DE PCR:

1. En el tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5 μL de Mix de PCR y 2.5 μL de agua de biología molecular, se mezcla bien. Este es el control negativo.
2. En otro tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de control positivo, mezclamos bien.
3. De nuevo en un tubo de 0.2 mL dispensamos 22.5μL de Mix de PCR y 2.5μL de ADN, mezclamos bien.
4. Pasamos los tubos al termociclador. 

OBSERVACIONES

En el caso de de la preparación del gel las cantidades estaban dadas por el protocolo para geles de 7x7, pero en nuestro laboratorio no hay moldes de ese tamaño, si no más grandes, así que tuvimos que volver a hacer el protocolo como para otro gel, calentar la mezcla que teníamos y juntarlos para hacer un solo gel. El resultado fue bueno.

Extracción ADN de la Saliva

OBJETIVO

Extraer nuestro ADN para que lo podamos trabajar con él en la siguiente práctica.

MATERIALES

• Solución de Lisis
• Proteinasa K 
• Solución de Acetato de Sodio 
• Etanol absoluto
• Tubo ependorf
• Tubo de centrífuga
• Pipeta pasteur
• Asas de siembra
• Pipetas graduadas y puntas
• Agua de biología molecular

PROCEDIMIENTO 

1. Obtenemos la muestra de saliva, para ello nos enjuagamos antes con agua, luego nos rascamos un poco la mucosa bucal y la lengua con un asa de siembra para una mayor cantidad de ADN y nos enjuagamos con suero fisiológico.
2. Recogemos  10 mL de saliva con el suero fisiológico en un tubo cónico, nos ayudamos de un embudo.
3. Añadimos 1 mL de Solución de Lisis al tubo con la muestra.
4. Mezclamos por inversión.
5. Con la micropipeta añadimos 20 μL de Proteinasa K, para ello apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale.
6. Mezclamos por inversión.
7. Incubamos durante 10 minutos y agitamos cada 3 minutos.
8. Añadimos 200 μL de Acetato de Sodio, mezclamos por inversión.
9. Con una pipeta pasteur añadimos 3 mL de Etanol, que tiene que estar bien frío. Apoyamos la pipeta en la pared del tubo y dejamos que el líquido resbale lentamente.
10. Incubamos durante 2 min sin moverlo.
11. Mezclamos por inmersión muy lentamente.
12. Nos aparece una madeja de ADN que capturaremos con un asa de siembra y llevaremos a un eppendorf.
13. Para conservar el ADN para otro día llenamos el eppendorf con tampón de hidratación y metemos en el congelador.

OBSERVACIONES

Después de obtener la saliva con el suero fisiológico centrifugamos hasta obtener un pellet y después continuamos con el protocolo disolviendo el pellet todo lo posible por inversión, pero finalmente obtuvimos el ADN.

Continuamos con la Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Continuamos la práctica anterior.

MATERIALES

• 5 μL de producto de PCR
• 5μL Tampón de carga
• Agua de biología molecular
• Marcador de peso molecular
• Tampón de electroforesis
• Cubeta electroforesis
•  Gel electroforesis

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la muestra con 5 μL de nuestro producto de PCR, 5μL de tampón de carga y 10 μL de agua de biología molecular, y resuspendemos
2. Por cada peine, en nuestro caso dos, 4 μL de marcador de peso molecular, 5 μL de tampón de carga y 11 μL de agua de biología molecular
3. Llenamos la cubeta con tampón de electroforesis e introducimos el gel 
4. Procedemos a insertar nuestras muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación del gel 
5. Conectamos la cubeta a la fuente a un voltaje constante 35 min 
6. Visualizamos en el transiluminador 

OBSERVACIONES

Hay que prestar mucha atención ha no mover la cubeta de la electroforesis por que el gel que queda adherido puede despegarse y dificultar la carga de las muestras en los pocillos del gel.

Mutación Puntual en Trombosis

OBJETIVO

Con esta práctica usamos nuestros conocimientos sobre PCR y electroforesis aplicados a la detección de la mutación de la trombosis buscando genes asociados a distintos factores de la coagulación.

MATERIALES

• Eppendorff
• Agua ultrapura
• Muestra ADN
• Tampón 5x
• Primers F y R 
• Taq polimerasa

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos a un tubo eppendorff 13,6 μL de agua ultrapura
2. Pipeteamos 5 μL de ADN y 5 μL de tampón 5x
3. Agregamos 0.5 μL de Primer R y 0.5 μL de Primers F
4. Añadimos 0.4 μL de Taq polimerasa, es lo últimpo que haremos para que no empiece su actividad hasta que esté todo en el tubo eppendorff
5. Ponemos en el termociclador el programa adecuado 

OBSERVACIONES

Al día siguiente continuaremos la practica preparándola para visualizarla en un transiluminador.

Determinación de la Pureza del ADN : Espectrofotómetro

OBJETIVO

Aprender a usar el espectrofotómetro y medir la pureza de nuestro ADN genómico de la anterior práctica.

MATERIALES

• ADN genómico
• Tris HCl (pH 8)
• EDTA 0.001M

PROCEDIMIENTO

1. Encendemos el espectofotómetro 10-20 minutos antes de empezar a medir 
2. Preparamos 4 mL TE, mezclando 2 mL de EDTA y 2 mL de agua destilada
3. Añadimos en un tubo de ensayo 1 mL de TE, más 50 μL de muestra de ADN purificada y resuspender y por último 1.45 mL más de TBE y mezclar
4. Colocar el espectrofotómetro a una λ=260 nm
5. Ponemos ''el blanco'' con tampón de TBE en una cubeta, esto sirve para no tener en cuenta la absorbancia que no sea de ADN 
6. Medimos la dilución del punto 3
7. Anotamos la absorbancia 
8. Sacamos la muestra del espectofotómetro
9. Modificamos la absorbancia a una λ= 280 nm
10. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
11. Modificamos la absorbancia a una λ= 230 nm
12. Repetimos los pasos 5, 6, 7, 8
13. Realizamos los cálculos pertinentes para determinar la pureza

OBSERVACIONES

No tocar las paredes que debe de atravesar la luz en la cubeta y también vigilar que esta no esté rallada.

Continuamos con la Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO 

Continuamos con la práctica del lunes, para ello necesitaremos los materiales del día anterior.

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 500 μL de Tampón de deshinibición en el nuevo tubo de recolección, centrifugamos 12000-14000 rpm durante 60 segundos y eleminanos el líquido
2. Añadimos 500 μL de Tampón de Lavado en el reservorio de la Spin columna y centrifugamos a 12000 rpm durante 60 segundos y eleminamos el líquido
3. Hacemos un segundo lavado, de nuevo otros 500 μL de Tampón de Lavado, centrifugamos a 14000 rpm durante 60 segundos y volvemos a retirar el liquido
4. Centrifugamos a máxima velocidad durante 2 minutos y eliminamos el alcohol residual
5. Eliminamos  el tubo de recogida y ponemos un eppendorff, añadimos 200 μL de Tampón de Elución precalentado a 70ºC e incubamos 1 minuto a temperatura ambiente
6. Por último centriffugamos a máxima velocidad durante 60 segundos y ya tenemos el ADN genómico en nuestro tubo eppendorff

OBSERVACIONES

El riesgo que tiene hacer esta práctica en dos partes es por ejemplo que el dejar el etanol, sin hacer los lavados pertinentes, durante tanto tiempo con nuestro ADN puede dañarlo, por eso lo ideal es llevar a cabo esta práctica de una vez, cosa que no hemos podido llevar a cabo por los horarios de clase.

Extracción de ADN Genómico

OBJETIVO

Aprender a obtener una rápida extracción y purificación de ADN genómico de alta calidad a partir de sangre total utilizando Spin columnas con membrana de silica que une selectivamente el ADN

MATERIALES

• 900 μL Tampón de Lisis
• 300 μL de sangre total
• 180 μLTampón de Lisis de Tejidos
• 25 μL de Proteinasa K 
• 200 μL Tampón de Lisis/unión
• 200 μL etanol
• MicroSpin columna y varios tubos de recolección 
• 500 μL Tampón de Deshinibición
• 1 mL Tampón de Lavado
•  200 μL Tampón Elución 
• Tubos eppendorff

PROCEDIMIENTO

1. Pipeteamos 300 μL de sangre en un microtubo de 1.5 mL y añadimos 900 μL de Tampón de Lisis, mezclándolo con un vortex e incubándolo 10 minutos a temperatura ambiente
2. Se centrifuga a la máxima potencia durante un minuto y quitamos el sobrenadante por decantación, dejando 10μL-20 de líquido residual y después vortex
3. Añadimos 180 μL de Tampón de Lisis de Tejidos más 25 μL de Proteinasa K y mezclamos con un votex 2 o 5 segundos
4. Incubar a 56ºC durante 10 minutos 
5. Añadimos 200 μL de Tampón de Lisis/unión, mezclamos con vortex e incubamos a 70ºC durante 10 minutos
6. Añadimos 200 μL de Etanol (96%-100%) y mezclamos con vortex
7. Ahora lo pasamos a MicroSpin columna 
8. Centrifugamos a 8000 rpm durante 60 segundos eliminamos el tubo y ponemos un nuevo tubo de recolección  

OBSERVACIONES

El protocolo no acaba aquí pero en nuestro caso lo continuaremos al día siguiente, quedándonos en el paso 8.

Electroforesis

OBJETIVO

Aprender a realizar una electroforesis

MATERIAL

• Tampón de electroforesis
• Gel de electroforesis
• Cubeta de electroforesis
• Escalera de muestras
• Pipetas 5 μL

PROCEDIMIENTO

1. Preparamos la cubeta añadiendo el tampón de electroforesis y sumergimos el gel de agarosa grande que hicimos el día anterior
2. Vamos pipeteando 5μL de las escaleras de muestras en los pocillos del gel 
3. Conectamos la cubeta a la corriente a un voltaje constante de 130 V durante 35 min
4. Desconectar de la fuente
5. Sacamos el gel de la cubeta lo secamos cuidadosamente y lo colocamos en el transiluminador UV para observar los resultados

Preparación del Gel de Agarosa y Tampón de Electroforesis

OBJETIVO

Preparar los reactivos (gel de agarosa y tampón de electroforesis) para poder llevar a cabo una electroforesis.

MATERIALES

• Bandeja con peine
• Agarosa
• TBE 10x
• TBE 1x
• Agarosa 100g
• Microondas
• Pipeta y prepipeta
• Matraz Erlenmeyer
• Probeta
• Agua destilada
• Colorante Midori Green
• Agua para biología molecular

PROCEDIMIENTO: TAMPÓN ELECTROFORESIS

1. Añadimos a una probeta de 300 mL un poco de agua destilada y después los 30 mL de TBE10x 
2. Añadimos agua destilada hasta 300 mL 
3. Mezclamos

PROCEDIMIENTO: AGAROSA

1. Preparamos la bandeja con el peine 
2. Pesamos la agarosa (1g) directamente en el matraz erlenmeyer y añadimos los 50 mL de TBE
3. Lo introducimos en el microondas y vamos comprobando y agitando el vaso de vez en cuando hasta que se vuelva transparente 
4. Añadimos 5 µl de Midori Green a la agarosa líquida, movemos para distribuir uniformemente 
5. Lo vertimos cuidadosamente en la bandeja con el peine colocado para evitar la formación de burbujas
6. Dejamos que polimerice a temperatura ambiente hasta que la agarosa deje de estar transparente
7. Quitamos el peine levantándolo cuidadosamente y evitando moverlo hacia los lados para no mover los pocillos

OBSERVACIONES

También se realizó un gel de electroforesis grande con un mayor número de peines para que en la próxima practica toda la clase practicara sobre el mismo gel.

Cargar el Gel de Electroforesis

OBJETIVO

Simulación para aprender a cargar el gel de electroforesis.

MATERIAL

• Gel de silicona
• Pipeta y pintas de pipeta
• Cubeta con agua 
• Microtubo con agua y colorante

PROCEDIMIENTO

1. Una vez que tenemos la cubeta con agua suficiente como para sumergir el gel, lo introducimos y lo dejamos pegado al fondo
2. Introducimos la pipeta de 5 µl con cuidado y cargamos el gel
3. Después lo sacamos y lo secamos cuidadosamente

OBSERVACIONES

Es importante no introducir demasiado la pinta en el gel o podríamos bloquear el pipeteo o por el contrario no adentrarnos lo suficiente en el gel.

Continuamos con la Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIAL

• Nuestro tubo cónico con la preparación
• NaCl saturado 
• Etanol absoluto 
• Etanol 70% 
• 2 microtubos
• Varilla 
• Agua estéril destilada
• Gradilla

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos 160  μL de NaCl y lo llevamos al vortex
2. Añadimos dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclamos por inmersión observando la formación de un ovillo de ADN precipitado
3. 
   
4. Capturamos la madeja de ADN  con una varilla 
5. Lavamos la madeja con un microtubo con etanol al 70% 
6. Dejamos secar el ADN  en la varilla durante 30 minuto, apoyando la varilla sobre una gradilla y la pasamos a un microtubo vacío 
7. La resuspendemos en 300  μL de agua estéril destilada 

OBSERVACIONES

En nuestra primera preparación no obtuvimos el ADN de la sangre, esta era muy oscura pero realmente no sabemos cual fue el problema en concreto, en vista de que el color de nuestra sangre y los resultados que obteníamos tras los pasos, decidimos que a parte de acabar hoy la práctica con esa muestra iniciaríamos otra vez la práctica con otra muestra distinta de sangre.

Así que la segunda muestra se quedó en incubación a temperatura ambiente durante la noche y al día siguiente pudimos capturar su ADN.

Extracción de ADN en Sangre Periférica

OBJETIVO

Aprender a aislar el ADN de una muestra que en este caso es de sangre, al ser la más común, evitando la contaminación.

MATERIALES

• Muestra de sangre
• Tampón de lisis (Tris-HCl 10mM, MgCl2 5mM, Sacarosa 0.32M, Tritón-X100 1%)
• NaCl 0.9%
• SDS 20%
• Proteinasa K
• Tubo cónico
• Agua biología molecular

PROCEDIMIENTO

1. Lo primero que vamos ha hacer es preparar el NaCl de 4M, 3.5g , añadimos agua de biología molecular hasta 10mL y disolvemos con un agitador magnético, lo dejamos a temperatura ambiente hasta su uso
   
2. Partimos de 2 mL de sangre periférica en EDTA 
3. Añadimos 10 mL de tampón de lisis y mezclamos por inversión 
4. Dejamos en la nevera 30 min 
5. Centrifugación 15 min a 2500 rpm, retiramos sobrenadante por decantación
6. Añadimos NaCl 0.9% hasta 4 mL y disolvemos el pellet
7. Centrifugar 15 min po a 2500 rpm 
8. Eliminar sobrenadante por decantación
9. Añadir 160 μL de taampón de lisis, 25 μL de SDS 20% y 2.5 μL de Proteinasa K y agitamos con vortex
10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche 

OBSERVACIONES

Con el fin de obtener un mejor resultado se dejaron 35 minutos en vez de 30 el tubo con la sangre y el tampón de Lisis.